رني بوساطة ضربة قاضية جين مزدوجة وذوقي قياس مدركات في عسل النحل (<em> mellifera أبيس</em>)
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجيتين التي تقمع في وقت واحد اثنين من الجينات (مزدوجة ضربة قاضية الجينات) في نحل العسل. ثم نقدم كيفية استخدام استجابة تمديد خرطوم (PER) مقايسة لدراسة تأثير مزدوج ضربة قاضية الجينات على عسل النحل التصور الذوقية.
Abstract
يوضح هذا الفيديو تقنيات الرواية من تدخل الحمض النووي الريبي (رني) الذي القيام بعملية التنظيم التقليلي اثنين من الجينات في وقت واحد في نحل العسل باستخدام الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل. كما يعرض بروتوكولا للخرطوم استجابة الإرشاد (PER) فحص لقياس الإدراك الذوقية.
رني بوساطة ضربة قاضية الجين هو أسلوب فعال downregulating الهدف التعبير الجيني. وعادة ما تستخدم هذه التقنية للتلاعب جين واحد، لكن له حدود للكشف عن التفاعلات والآثار المشتركة بين الجينات. في الجزء الأول من هذا الفيديو، نقدم استراتيجيتين لضرب أسفل في وقت واحد اثنين من الجينات (وتسمى مزدوجة ضربة قاضية الجينات). نعرض كل الاستراتيجيات قادرون على قمع فعالية اثنين من الجينات، vitellogenin (VG) وultraspiracle (USP)، والتي هي في حلقة ردود فعل التنظيمية. هذا النهج المزدوج ضربة قاضية الجينات يمكن أن تستخدم لتشريح العلاقات المتبادلة بين الجينات ويمكن تطبيقها بسهولة فيأنواع الحشرات المختلفة.
الجزء الثاني من هذا الفيديو هو دليل على خرطوم تمديد استجابة (PER) الفحص في نحل العسل بعد العلاج من ضعف ضربة قاضية الجينات. مقايسة PER هو اختبار معيار لقياس الإدراك الذوقية في النحل والعسل، والتي تعد مؤشرا رئيسيا لمدى سرعة نضوج نحلة العسل والسلوكي هو. تصور الذوقية أكبر من النحل عش يشير إلى زيادة التنمية السلوكية التي كثيرا ما يرتبط مع سن مبكرة في بداية البحث عن الطعام والعلف التخصص في حبوب اللقاح. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق PER فحص لتحديد الدول الأيضية من شبع أو الجوع في نحل العسل. وأخيرا، PER الفحص جنبا إلى جنب مع الاقتران المحفزات رائحة مختلفة للتكييف كما انها تستخدم على نطاق واسع النحل للتعلم والذاكرة دراسات في نحل العسل.
Introduction
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو الحمض النووي الريبي على إسكات الجينات في مرحلة ما بعد النسخي، والذي يحدث في طائفة واسعة من الكائنات الحية حقيقية النواة. يتم تشغيل عملية رني بالنقر المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) السلائف داخلية أم خارجية. الرنا المزدوج الجديلة ينشط بروتين المقامر ريبونوكلياز الذي يربط ويشق الرنا المزدوج الجديلة إلى شظايا صغيرة (20-25 BP). ثم شظايا صغيرة من الرنا المزدوج الجديلة دليل على الاعتراف وتشطر من mRNAs والتكميلية من البروتينات argonaute، وهو عنصر حفاز من مجمع إسكات الحمض النووي الريبي التي يسببها (RISC) 1. في الثدييات، dsRNAs أطول من 30 NT، تنشيط استجابة المضادة للفيروسات (الإنترفيرون استجابة، IFN) الذي يؤدي إلى تدهور غير محددة من الحمض النووي الريبي النصوص 2. ومع ذلك، فقد ثبت dsRNAs طويلا لتكون فعالة ومحددة في الحشرات لأنه ليس هناك نقص في هذا الإنترفيرون 3.
وقد استخدمت dsRNAs طويلة لdownregulation من الجينات المستهدفة في أنواع الحشرات المختلفة. نحل العسل هي واحدة من بيونالكائنات الحشرات EER التي قد كشفت مهام العديد من الجينات الهامة في تطوير والسلوك باستخدام الرنا المزدوج الجديلة 4،5. وقد أجريت عدة طرق التسليم الرنا المزدوج الجديلة في نحل العسل: التغذية الرنا المزدوج الجديلة downregulates بكفاءة الهدف التعبير الجيني في يرقات نحل العسل 6، في حين حقن الرنا المزدوج الجديلة هو نهج فعالة لضربة قاضية الجينات في الأجنة العسل النحل 4 والنحل الكبار 7،8.
آثار ضربة قاضية الجينات التي أظهرتها تطبيق الرنا المزدوج الجديلة للحشرات هي عابرة والمترجمة. وقد أظهرت الدراسات أن كلا من حقن الرنا المزدوج الجديلة البطن وحقن الرنا المزدوج الجديلة الصدري قمع بفعالية الهدف التعبير الجيني في خلايا الجسم من الدهون في منطقة البطن من الحشرات 9،10. يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة في تجاويف البطن والصدر وخلايا الدهون في الجسم هي قادرة على تولي الرنا المزدوج الجديلة من الدملمف حيث استحم الخلايا 10. ومع ذلك، لا يمكن استهداف الجينات في الأجهزة الأخرى، مثل المبايض والعقول، إما عن طريقالحقن في البطن أو الصدر. من أجل استهداف الجينات في نحل العسل الدماغ، كما تم إجراء حقن الدماغ من الرنا المزدوج الجديلة، الأمر الذي يؤثر بشكل فعال الهدف التعبير الجيني في مناطق الدماغ المحلية 11. هنا، ونحن الوثيقة الوحيدة حقن الرنا المزدوج الجديلة البطن وهو أكثر شيوعا في عسل النحل الكبار.
تم رني تستخدم في المقام الأول لاستهداف جين واحد وكان أداة قوية لتكشف عن وظيفة الجين. ومع ذلك، أي الجينات ليست معزولة عن الآخرين، بل هو في الشبكات التنظيمية المعقدة. مفتاح لفهم عملية بيولوجية هو لتشريح كيفية تفاعل الجينات مع بعضها البعض، الأمر الذي يتطلب التلاعب في وقت واحد من جينات متعددة بدلا من ضربة قاضية جين واحد. في خطوط خلايا الثدييات، نجح العلماء في تثبيط وقت واحد اثنين أو ثلاثة جينات باستخدام نظم التوصيل 12 أو متعدد الرنا الميكروي (ميرنا) تصاميم دبوس 13. ولكن في الحشرات، متعددة knockdowns الجين لا تزال غير مجربة. هنا، ونحن حاضرار استراتيجيات الحقن المختلفة التي يمكن تحقيق ضربة قاضية الجينات مزدوجة. نحن استهداف اثنين من الجينات: vitellogenin (VG) الذي يشفر بروتين تمهيدا صفار البيض، وultraspiracle (USP) الذي يشفر مستقبلات لهرمون المفترضة الأحداث (JH) ويمكن أن تكون بمثابة عامل النسخ الوساطة الردود على JH 14 في نحل العسل. VG وJH تنظيم بعضها البعض في حلقة التغذية المرتدة 15 ويشاركون في عسل النحل السلوكية المادة 9. باستخدام الجينات ضربة قاضية مزدوجة، ونحن التشويش على حد سواء VG والممرات JH، واكتشاف كيف أنها تؤثر على سلوك النحل العسل معا وعلم وظائف الأعضاء وكيفية VG، جامعة جنوب المحيط الهادئ وJH التفاعل 9.
تصور الذوقية يشكل مؤشرا السلوكية لنحل العسل السلوك الاجتماعي 16. من حيث التنمية السلوكية، والنحل عش مع التصور الذوقية العالية سلوكيا سريع ناضجة، وعادة العلف في وقت مبكر من الحياة، ويفضلون لجمع حبوب اللقاح 16،17. وعلى الرغم م التنظيميةechanisms الكامنة وراء الإدراك ذوقي لا تزال غير واضحة، وقد أظهرت الدراسات أن الإدراك ذوقي مرتبط الأيض الداخلية الطاقة 9، 18،19 إفراز الهرمونات والبيوجينية أمين مسارات 20. كلا VG وJH هي المنظمين الهرمونية المهم تحوير الإدراك ذوقي 7،21. في المختبر، والاختلاف في التصور الذوقية في نحل العسل يمكن تقييمها من خلال اختبار الاستجابة تمديد خرطوم (PER) إلى حلول السكروز مختلفة. يتم اختبار كل نحلة على حد سواء عن طريق لمس هوائيات لها مع قطرات من الماء يعقبه سلسلة تصاعدي تركيز 0.1، 0.3، 1، 3، 10، 30٪ سكروز. ويلاحظ استجابة إيجابية إذا نحلة تمتد بالكامل خرطوم لها عندما لمست قطرات من الماء أو السكروز إلى كل هوائي. استنادا إلى عدد من الردود الإيجابية إلى حلول، ومستوى الإدراك الذوقي كل فرد يمكن تحديد 16. ومع ذلك، فإن تطبيق PER لا يقتصر على قياس زتصور ustatory. وPER هو أيضا وسيلة فعالة لاختبار حالة الأيض من النحل مثل شبع مقابل الجوع. النحل مع أكبر الردود على السكروز هي جوعا في العام (وانغ وAmdam، بيانات غير منشورة). وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن نموذج PER استخدامها في التعلم النقابي والذاكرة في نحل العسل. في هذه الحالة سوف يتم تدريب النحل على المنتسبين وجود الماء السكروز مع رائحة. عندما تعلم النحل الرابطة، فقط وجود رائحة يمكن أن تثير استجابة إيجابية خرطوم دون مكافأتهم مع السكروز 22،23. في هذا الفيديو، وتبين لنا كيفية تنفيذ PER لتقييم الإدراك الذوقية التي قد تم توصيله مع VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ ضربة قاضية مزدوجة في دراسة سابقة 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراستنا هي أول جهد لضرب أسفل في وقت واحد في اثنين من الجينات الحشرات الكبار. نتائجنا تظهر أن استراتيجيات اثنين من الرنا المزدوج الجديلة حقن (حقنة واحدة والحقن لمدة يومين) فعالة لقمع الجينات مزدوجة، وإسكات الجينات في وقت واحد من VG وجامعة جنوب المحيط الهادئ يمكن ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ايرين Fennern لمساعدة التجربة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث في النرويج (180504، 185306 و191699)، PEW ترست الخيرية، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA P01 AG22500).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. . Hormones, Brain and Behavio. , (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
