RNAi-опосредованной Двухместный Нокдаун гена и вкусовые восприятия измерений в медоносных пчел (<em> Apis MELLIFERA</em>)
Summary
В этом протоколе, мы описываем две стратегии, которые одновременно подавляют два гена (двойной нокдаун гена) в медоносных пчел. Затем мы представляем, как использовать хоботком ответ расширения (PER) анализа для изучения влияния двойного нокдауна гена на пчелиный мед вкусового восприятия.
Abstract
Это видео демонстрирует роман метода РНК-интерференции (РНК-интерференции), которые подавляют двух генов одновременно в медоносных пчел использованием двухцепочечной РНК (дцРНК) инъекций. В нем также представлены протокол хоботка расширение ответа (PER) анализа для измерения вкусового восприятия.
RNAi-опосредованной генной нокдаун является эффективным методом понижающей регуляции экспрессию гена-мишени. Этот метод обычно используется для одной манипуляции генов, но он имеет свои ограничения для обнаружения взаимодействия и совместные эффекты между генами. В первой части этого видео, мы представляем две стратегии одновременно сбить двух генов (так называемый двойной нокдаун гена). Мы покажем, как стратегии способны эффективно подавлять двух генов, вителлогенин (VG) и ultraspiracle (USP), которые находятся в нормативных обратной связи. Этот двойной подход нокдауна гена может быть использовано, чтобы анализировать взаимосвязи между генами и могут легко применяться вразличных видов насекомых.
Вторая часть этого видео является демонстрацией хоботка расширение ответа (PER) в анализе медоносных пчел после обработки двойного нокдауна гена. На анализ является стандартным тестом для измерения вкусового восприятия в мед пчелы, которая является ключевым предиктором как быстро поведенческих созревания меда пчелы есть. Большой вкусового восприятия гнезда пчел указывает на повышенный поведенческое развитие, которое часто связано с более ранним возрастом начала кормления и кормления специализации в пыльце. Кроме того, на анализ может быть применен для идентификации метаболического состояния сытости или голода в медоносных пчел. Наконец, на анализ в сочетании со спариванием различных стимулов для кондиционирования запахом пчел также широко используется для обучения и памяти в исследования медоносных пчел.
Introduction
Интерференции РНК (RNAi) представляет собой РНК на основе пост-транскрипционный генов, которое происходит в различных эукариотических организмов. Процесс РНК-интерференции вызваны эндогенными или экзогенными двухцепочечной РНК (дцРНК) прекурсоров. ДсРНК активирует рибонуклеазы Dicer белок, который связывает и расщепляет дсРНК к небольшим фрагментам (20-25 б.п.). Затем небольшие фрагменты направляющей дцРНК признание и расщепление дополнительный мРНК по Argonaute белки, каталитический компонент РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC) 1. У млекопитающих дцРНК длиннее 30 нуклеотидов, активирует противовирусный ответ (интерферон ответ IFN), что приводит к неспецифической деградации РНК-транскрипты 2. Однако длинные дцРНК доказали свою эффективность и конкретные насекомых, поскольку существует недостаток этого IFN 3.
Длинные дцРНК были использованы для понижающей регуляции генов-мишеней в различных видов насекомых. Медоносные пчелы являются одним из пионовEER организмов насекомых, в котором функции многих важных генов в развитии и поведении были выявлены с помощью дсРНК 4,5. Несколько доставки дсРНК методов были проведены в медоносных пчел: дсРНК кормления эффективно подавляет экспрессию гена-мишени в меде 6 личинок пчел, тогда как дсРНК инъекций является эффективным подходом для генной нокдаун в мед пчелы эмбрионов 4 и взрослых пчел 7,8.
Нокдаун гена выставлены эффекты, применяя дсРНК для насекомых являются преходящими и локализованными. Исследования показали, что обе инъекции дсРНК брюшной и грудной инъекции дсРНК эффективно подавляют экспрессию гена-мишени в клетках жира в брюшной полости тела насекомых 9,10. ДсРНК вводится в брюшной и грудной полостей и жировые клетки тела в состоянии взять на себя дсРНК из гемолимфы, где клетки купаются 10. Однако гены в других органах, таких как мозг и яичников, не могут быть направлены либобрюшной полости или грудной инъекций. В целях выявления генов в мозге пчелы мед, мозг инъекцию дсРНК также была выполнена, которая эффективно воздействует на экспрессию гена-мишени в локальных областях мозга 11. Здесь мы единственный документ уколами дсРНК который чаще используется в взрослые пчелы.
РНК-интерференции была в первую очередь используется для целевого одного гена и был мощным инструментом, чтобы выявить функции гена. Тем не менее, любой ген не изолирована от других, она находится в сложных регуляторных сетей. Ключом к пониманию биологического процесса является рассекать как гены взаимодействуют друг с другом, что требует одновременного манипуляции нескольких генов, а не одного нокдаун гена. В линии клеток млекопитающих, ученые добились успеха в одновременном ингибировании двух или трех генов с помощью систем доставки 12 или нескольких микроРНК (микроРНК) шпильки конструкции 13. Но у насекомых, несколько нокдаунов гена еще не проверены. Здесь мы Presenт различных стратегий для инъекций, которые могут достичь двойного нокдауна гена. Мы целевой двух генов: вителлогенина (VG), который кодирует предшественник белка желток и ultraspiracle (USP), который кодирует предполагаемый рецептор для ювенильного гормона (JH) и может служить в качестве транскрипционного фактора посредническую ответов на JH 14 в пчелам. В.Г., JH регулируют друг друга в цепи обратной связи 15 и участвуют в мед пчелы регуляции поведения 9. Использование двойного нокдауна гена, Возмутим как В.Г., JH путей, и узнать, как они оказывают совокупное воздействие меда пчелы поведение и физиологию и как В.Г., USP и JH взаимодействуют 9.
Вкусовое восприятие поведенческих предиктором пчелиного меда социальное поведение 16. С точки зрения поведенческого развития, гнезда пчел с высокой вкусового восприятия поведенчески зрелых быстро, и, как правило корма в раннем возрасте и предпочитают собирать пыльцу 16,17. Хотя нормативные мechanisms вкусового восприятия, лежащие в основе по-прежнему неясны, исследования показали, что вкусовое восприятие связано с внутренним метаболизмом энергии 9, 18,19 гормональной секреции и биогенетическая амина путей, 20. Оба В.Г., JH важных гормональных регуляторов модуляции 7,21 вкусового восприятия. В лаборатории, изменение вкусового восприятия в медоносных пчел может быть оценена тестированием хоботком ответа абонента (PER) для различных решений сахарозы. Каждая пчела проверяется прикосновения обе антенны ее с каплей воды, а затем восходящей серии концентрации 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% сахарозы. Положительный ответ Отмечается, если пчелы полностью протягивает хобот, когда капли воды или сахароза касанием для каждой антенны. На основе количества положительных ответов на решения, вкусовые уровень восприятия каждого отдельного может быть определена 16. Тем не менее, применение PER не ограничивается измерения гustatory восприятия. PER также является эффективным методом для проверки метаболическое состояние пчел, таких как насыщение против голода. Пчелы с большей ответов на сахарозу голоднее в целом (Wang и Amdam, неопубликованные данные). Кроме того, PER парадигма также может быть использован в ассоциативных обучения и памяти у пчел. В этом случае пчелы будут обучаться связать присутствии сахарозы воду с запахом. Когда пчелы узнать ассоциации, только наличие запах может вызывать положительный ответ хобот без награждение их с сахарозой 22,23. В этом видео мы покажем, как выполнить за одну оценить вкусовые восприятия, которое было связано с В.Г. и USP двойной нокдаун в предыдущем исследовании 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наше исследование является первой попыткой одновременно сбить два гена у взрослых насекомых. Наши результаты показывают, что две стратегии дцРНК инъекций (одной инъекции и двухдневный инъекций) являются эффективными для двойной подавление гена, и одновременное глушителей гена В.Г.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эрин Fennern для оказания помощи эксперимента. Эта работа финансировалась Исследовательским советом Норвегии (180504, 185306 и 191699), Пью Благотворительный фонд и Национальный институт по проблемам старения (NIA AG22500 P01).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Wax plate |
References
- Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
- Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
- Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
- Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
- Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
- Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
- Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
- Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
- Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
- Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
- Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
- Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
- Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
- Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
- Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
- Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
- Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
- Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
- Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E., Pfaff, D., et al. . Hormones, Brain and Behavio. , (2009).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
- Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
- Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
- Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
- Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
- Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
- Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
- Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).
