Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.
Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell'organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l'organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l'uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.
L'avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base 1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l'espressione di proteine imprevisti, come le proteine citoscheletriche 2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significativa tra anche un singolo tipo di cellula all'interno un intero organismo. Le cellule endoteliali in particolare mostrano comportamenti diversi in base al fatto che la linea arterie o vene e che tipo di flusso è presente nel recipiente 3. Ancor più pressante da una prospettiva evolutiva, tuttavia, è che la stragrande maggioranza delle linee cellulari disponibili sono derivati da tessuti adulti (vedi, ad esempio tegli collezione disponibile tramite ATCC). Queste linee cellulari adulte probabilmente non ricapitolano la natura dinamica dei loro precursori embrionali. La rapida evoluzione spazio-temporali pattern di espressione genica osservati durante lo sviluppo suggeriscono anche che una cellula endoteliale da un organo in un determinato stadio di sviluppo non può comportarsi allo stesso modo di una cellula endoteliale, da quello stesso organo, in una fase di sviluppo diverso.
Come alternativa all'utilizzo di linee cellulari immortalizzate disponibili in commercio, cellule primarie possono essere isolate dal tessuto specifico di interesse. Tra i vantaggi di questa tecnica, queste cellule primarie possono essere isolati da un organo specifico o anche parte di un organo in qualsiasi stadio di sviluppo specifico. Inoltre, queste cellule primarie possono essere isolati dalla grande varietà di animali transgenici disponibili, permettendo lo studio in vitro del gene knockout e knock-in, evitando altri problemi come l'efficienza di trasfezione. Non sorprende che moltitecniche sono stati pubblicati in dettaglio come isolare specifici tipi di cellule 4,5. In generale, queste tecniche implicano la raccolta della regione di interesse, dissociare le cellule, tagging il tipo cellulare specifico di interesse, e isolando quelle celle per ulteriori analisi.
Per studiare una popolazione precoce embrionale delle cellule endoteliali coronariche, abbiamo ridimensionato una tecnica 4 precedentemente pubblicato per l'uso con un organo più piccolo. Con questa procedura in scala ridotta, possiamo isolare le cellule endoteliali coronariche dal cuore embrionale in stadi embrionali specifici. Queste cellule possono quindi essere utilizzate in saggi tradizionali endoteliali, quali le analisi di migrazione. Fino ai primi di linee cellulari embrionali sempre più frequentemente, lavorando con le cellule primarie è una tecnica di inestimabile.
Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare de fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuov…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto, il microscopio Servizio Laboratorio di UNC per l'assistenza con il time-lapse imaging, e il NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.
REAGENTS | |||
Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
PBS (1x) | |||
Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
DMEM | Cellgro | ||
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
EQUIPMENT | |||
Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |