Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Summary

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Abstract

Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell'organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l'organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l'uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.

Introduction

L'avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base ^1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati ​​da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l'espressione di proteine ​​imprevisti, come le proteine ​​citoscheletriche ^2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significativa tra anche un singolo tipo di cellula all'interno un intero organismo. Le cellule endoteliali in particolare mostrano comportamenti diversi in base al fatto che la linea arterie o vene e che tipo di flusso è presente nel recipiente ^3. Ancor più pressante da una prospettiva evolutiva, tuttavia, è che la stragrande maggioranza delle linee cellulari disponibili sono derivati ​​da tessuti adulti (vedi, ad esempio tegli collezione disponibile tramite ATCC). Queste linee cellulari adulte probabilmente non ricapitolano la natura dinamica dei loro precursori embrionali. La rapida evoluzione spazio-temporali pattern di espressione genica osservati durante lo sviluppo suggeriscono anche che una cellula endoteliale da un organo in un determinato stadio di sviluppo non può comportarsi allo stesso modo di una cellula endoteliale, da quello stesso organo, in una fase di sviluppo diverso.

Come alternativa all'utilizzo di linee cellulari immortalizzate disponibili in commercio, cellule primarie possono essere isolate dal tessuto specifico di interesse. Tra i vantaggi di questa tecnica, queste cellule primarie possono essere isolati da un organo specifico o anche parte di un organo in qualsiasi stadio di sviluppo specifico. Inoltre, queste cellule primarie possono essere isolati dalla grande varietà di animali transgenici disponibili, permettendo lo studio in vitro del gene knockout e knock-in, evitando altri problemi come l'efficienza di trasfezione. Non sorprende che moltitecniche sono stati pubblicati in dettaglio come isolare specifici tipi di cellule ^4,5. In generale, queste tecniche implicano la raccolta della regione di interesse, dissociare le cellule, tagging il tipo cellulare specifico di interesse, e isolando quelle celle per ulteriori analisi.

Per studiare una popolazione precoce embrionale delle cellule endoteliali coronariche, abbiamo ridimensionato una tecnica ⁴ precedentemente pubblicato per l'uso con un organo più piccolo. Con questa procedura in scala ridotta, possiamo isolare le cellule endoteliali coronariche dal cuore embrionale in stadi embrionali specifici. Queste cellule possono quindi essere utilizzate in saggi tradizionali endoteliali, quali le analisi di migrazione. Fino ai primi di linee cellulari embrionali sempre più frequentemente, lavorando con le cellule primarie è una tecnica di inestimabile.

Protocol

1. Preparare Beads anticorpi coniugati Un giorno prima della dissezione, unire l'anticorpo di scelta con le Dynabeads appropriate (ad esempio ratto IgG Dynabeads per un anticorpo cresciuto in ratto, 4 x 10 8 perline / ml) per le istruzioni del produttore. Per il BD ratto anti-CD31 anticorpo (0,5 mg / mL, per isolare le cellule endoteliali), è aggiunto 3 anticorpo microlitri per ogni 25 microlitri perline, per una concentrazione finale di 1,5 mg anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7</sup…

Representative Results

Utilizzando un anticorpo specifico per endoteliale che riconosce CD31, le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli del embrionali (E) 13.5 (Figura 1A) e 18,5 (Figure 1B-1D) embrioni. Quando cresciuto su un piatto di coltura trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formerebbero un pattern di ciottoli se vicino confluenti (Figura 1A). Diluire il collagene è stato utilizzato anche per rivestire i pozzetti, e mentre le cellule endoteliali aderirà ad e…

Discussion

Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare de fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuov…

Materials

			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
Anti-mouse CD31	BD Bioscience	553370
Rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Collagen	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Collagenase, type I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Endothelial cell growth medium	(made in lab as described in notes)		DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Trypsin-EDTA	Gibco	25300
384-well culture plate	Greiner	T-3037-6	Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2
Collagen type I	BD	354236	Use at a final concentration of 1.5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Table-top centrifuge	Thermo	75002430