Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires
Summary
La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l'analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d'embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.
Abstract
La culture cellulaire a grandement amélioré notre capacité à évaluer les différentes populations de cellules dans des conditions de culture innombrables. Alors que des lignées cellulaires immortalisées offrent des avantages significatifs pour leur facilité d'utilisation, ces lignées cellulaires ne sont pas disponibles pour tous les types cellulaires potentiels. En isolant les cellules primaires à partir d'une région d'intérêt, en particulier à partir d'une souris transgénique, des études plus nuancées peuvent être effectuées. La technique de base consiste à disséquer l'organe ou partielle d'intérêt (par exemple le cœur ou une région spécifique du cœur) et dissocier l'organe de cellules individuelles. Ces cellules sont ensuite incubées avec des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps qui reconnaît le type de cellule d'intérêt. Les cellules d'intérêt peuvent alors être isolées à l'aide d'un aimant, par une courte incubation de la trypsine dissocier les cellules à partir des perles. Ces cellules isolées peuvent alors être cultivées et analysées comme vous le souhaitez. Cette technique a été conçu à l'origine pour orgue de souris adultes, mais peut être facilement réduite pour une utilisation avec les organes embryonnaires, comme le démontre le présent document. Parce que notre intérêt est dans le système vasculaire coronarien développement, nous avons voulu étudier cette population de cellules embryonnaires au cours des étapes spécifiques. Ainsi, le protocole initial a dû être modifié pour être compatible avec la petite taille des ventricules embryonnaires et le faible rendement potentiel des cellules endothéliales à ces stades de développement. En utilisant cette approche à échelle réduite, nous avons évalué coronaire remodelage plexus dans les cellules endothéliales transgéniques ventriculaires embryonnaires.
Introduction
L'avènement de lignées cellulaires immortalisées a révolutionné la biologie cellulaire de base 1. Les lignées cellulaires actuellement disponibles sont issus d'un large éventail d'organes et englobent tous les principaux types de cellules. Cependant, les lignées cellulaires établies ont certaines limites. Le processus d'immortalisation change évidemment le comportement des cellules, en particulier en ce qui concerne la durée de vie et la prolifération, mais peut également affecter l'expression des protéines inattendus, tels que les protéines du cytosquelette 2. En outre, bien que de nombreuses lignées cellulaires différentes sont disponibles, il ya une diversité importante chez un même type de cellule unique dans un organisme entier. Les cellules endothéliales en particulier montrent divers comportements selon qu'elles ligne artères ou des veines et quel type de flux est présent dans la cuve 3. Encore plus pressant dans une perspective développementale, cependant, est que la grande majorité des lignées cellulaires disponibles sont dérivées de tissus adultes (voir, par exemple til collecte disponible via ATCC). Ces lignées de cellules adultes susceptibles ne récapitulent la nature dynamique de leurs précurseurs embryonnaires. L'évolution rapide des modes d'expression des gènes au cours du développement spatio-temporelles observées suggèrent également qu'une cellule endothéliale d'un organe à un stade de développement donné peut ne pas se comporter de la même manière qu'une cellule endothéliale de ce même organe à un stade de développement différent.
Comme alternative à l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées disponibles dans le commerce, les cellules primaires peuvent être isolées à partir du tissu d'intérêt spécifique. Parmi les avantages de cette technique, ces cellules primaires peuvent être isolés à partir d'un organe spécifique ou même une partie d'un organe à n'importe quel stade de développement spécifique. En outre, ces cellules primaires peuvent être isolés de la grande variété d'animaux transgéniques disponibles, permettant l'étude in vitro des huitièmes de finale de gènes et knock-in tout en évitant d'autres problèmes tels que l'efficacité de la transfection in. Sans surprise, de nombreuxtechniques ont été publiés en détail comment isoler des types cellulaires spécifiques 4,5. En général, ces techniques consistent à recueillir la région d'intérêt, dissocier les cellules, le marquage du type de cellule spécifique d'intérêt, et d'isoler ces cellules pour une analyse ultérieure.
Pour étudier une population embryonnaire précoce des cellules endothéliales coronaires, on ramenait une technique 4 précédemment publié pour être utilisé avec un organe plus petit. Avec cette procédure allégée, nous pouvons isoler les cellules endothéliales coronaires du cœur embryonnaire à des stades embryonnaires spécifiques. Ces cellules peuvent ensuite être utilisés dans des essais endothéliales traditionnelles, telles que les analyses de migration. Jusqu'à ce que les lignées cellulaires embryonnaires deviennent plus nombreux, en collaboration avec les cellules primaires est une technique précieuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Travailler avec des cellules embryonnaires primaires permet des expériences nouvelles pour traiter in vitro étapes critiques du développement. Toutefois, la procédure d'isolement n'est pas anodin. Les étapes critiques pour isoler un type de cellules comprennent veillant à ce que les cellules sont bien séparés par digestion par la collagénase, puis qu'ils sont bien en suspension au cours des étapes de lavage. Dissection mécanique par pipetage contribue grandement séparer les cellules lors…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Andrea Portbury pour la lecture critique du manuscrit, le Laboratoire des services de microscope de l'UNC pour l'aide à la imagerie time-lapse, et le NIH (subvention n R01HL061656) pour le soutien financier.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
