诱导上皮和分析间质转化

Summary

一个直接的方法被描述为诱导上皮至间质转变（EMT）在各种细胞类型。方法对细胞的EMT状态的免疫细胞化学分析也包括在内。

Abstract

上皮间质转化（EMT）是在开发过程中适当的形态必不可少的。这个过程的错误调节已被认为在纤维化的关键事件和癌的进展为转移性状态。了解背后的EMT过程是刻不容缓的早期诊断和临床控制这些疾病状态。可靠的诱导EMT 的体外是药物发现的有用工具，以及确定共同的基因表达特征进行诊断。在这里，我们展示的诱导EMT中的各种细胞类型的一个简单方法。也包括方法细胞前和后的EMT诱导免疫细胞化学分析。此外，我们证明，通过基于抗体阵列分析和迁移/侵袭测定法本方法的有效性。

Introduction

上皮间质转化（EMT）是由哪一个极化上皮细胞经历了各种产生了高度能动，成纤维细胞样细胞的间充质转变的过程。这个过程发生时，部分地通过基因表达的变化和粘着连接的降解，导致迁移和侵入的能力增强。生理上，EMT的胚胎发育和伤口愈合过程中起着重要的作用。适当控制EMT的损失可能导致纤维化和^1,2癌转移。

E-钙粘蛋白的上皮细胞表面上的还原是在一个细胞通过EMT ^3,4进展的关键一步。 E-钙粘蛋白是一种单次跨膜蛋白，其直接与邻近的细胞钙粘蛋白相互作用。除了其在细胞粘附作用，E-cadherin的影响，通过细胞的E-cadherin蛋白的胞质尾之间的信令交互哒各种调控蛋白，特别是β-连环蛋白。 β-catenin在粘着连接的稳定起到了重要作用。在经典Wnt信号，β-连环蛋白是从E-cadherin蛋白释放并转移到它充当Wnt信号通路^3,4,5下游转录因子的细胞核。在细胞核中，β-连环蛋白已被证明能增加几个EMT相关的因素，包括扭，团状，纤连蛋白，以及多种基质金属蛋白酶^3,6的转录。

除了​​Wnts，TGF-β信号已被证明是既在正常发育和疾病状态^7,8,9中的EMT诱导中发挥显著作用。 TGF-β参与过程中腭的形成和发育的心脏¹⁰时所发生的EMT。它也被牵连纤维化和癌症进展到转移^7。

这里所描述的公关程序ovides一致诱导EMT的多种细胞类型中，而不需要的遗传操作。这个程序使用的是E-钙粘蛋白的鸡尾酒，SFRP-1和DKK-1阻断抗体和Wnt-5a和TGF-β1的重组蛋白。这种鸡尾酒的目的是阻止E-cadherin蛋白为基础的附着力，同时增强的Wnt和TGF-β信号。的能力为健壮的EMT诱导对于理解这个过程的生物学和如何操纵它用于治疗目的的关键。 EMT的电流共同标记，E-钙粘蛋白（在EMT下调）和波形蛋白（上调EMT），可以发现共表达于癌症，因此不提供潜在的转移性细胞¹²的最佳的诊断标志物。重要的是，各种已经历EMT的细胞类型的分析是有用的，以开发可用于癌症和纤维化¹¹诊断目的共同的基因表达特征。此外，最近的研究表明，电子MT可以在癌症干细胞的形成中发挥作用，这表明已经历EMT的细胞可以用于药物筛选可用于鉴定，可以针对这些细胞¹³的化合物。

Protocol

1。诱导的EMT 温暖的培养基至37℃的水浴中。所用的培养基是相同的用于您所关注的细胞的标准培养介质。例如，A549人肺癌细胞系生长在Kaighn氏F12补充10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺。 利息用解离液（ 如用TrypLE快递）收获细胞。 悬浮在15毫升锥形管中的细胞在预热的培养基。 离心细胞悬浮液以400×g离心5分钟。 小心地倒入垃圾容器中取出上清液。 悬浮在预热的培养基将细胞沉淀。 用台盼蓝计数活细胞。除去细胞悬浮液的样品和稀释在0.4％锥虫蓝溶液。将10微升稀释样品的血球计数及活细胞（细胞不变成蓝色）。用细胞计数来确定小区D密度的解决方案。 板细胞到组织培养物处理板或培养瓶在每平方厘米0.9〜1.0×10 4个细胞。例如，0.5×10 6细胞接种于100毫米的钢板在含1X EMT诱导培养基添加剂（6毫升媒体每100mm板）文化传媒。 培养接种的细胞在37℃/ 5％CO 2的培养箱中培养。每天监测细胞形态​​。 电镀后三天，取出纸张，换用含1X EMT诱导培养基补充新鲜预热的培养基。继续培养在37℃/ 5％CO 2培养箱。 电镀后五天，细胞准备用于分析。细胞形态由倒置显微镜观察。 2。通过免疫细胞蛋白表达的分析通过放置盖玻片在含95％乙醇的培养皿制备无菌12毫米盖玻片的24孔板中。轻轻地从我们的乙醇去除盖玻片ing一针和弯钳和火焰灭菌。放置无菌盖玻片到24孔板的一个孔中。重复剩余盖玻片。 准备细胞悬液中1.1节描述 – 1.7。 板1.6×10 4个细胞/孔在0.5ml含1X EMT诱导培养基补充预热的培养基。 增长和在部分1.9中描述养活细胞 – 1.11。 电镀后五天，除去介质和修复的细胞用300μl/孔的4％多聚甲醛在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中20分钟，在室温下进行。 除去固定剂和冲洗细胞2倍用1X PBS，500μL/孔。 培养细胞中加入400μl阻断缓冲液/孔（1X PBS中含有1％牛血清白蛋白（BSA），10％正常驴血清和0.3％的Triton X-100）1小时，在室温下进行。 在制造商中孵育一抗在400微升/推荐浓度以及封闭液3小时，在室温温度场的e或过夜，4°C。当使用直接缀合到荧光染料的初级抗体，孵育在黑暗中的样品。 在500μl的1×PBS /孔的含有0.1％BSA，每次5分钟洗涤液洗涤细胞3次。当使用直接进行荧光标记一抗，直接进行步骤2.12。 在400μl的1×PBS /孔的含有1％BSA进行1小时，在室温下在黑暗中孵育细胞中二级抗体在制造商推荐的浓度在500μl的1×PBS /孔的含有0.1％BSA，每次5分钟洗涤液洗涤细胞3次。 如果需要的话，对细胞核用DAPI溶液。 冲洗细胞，去离子水和盖玻片安装面朝下使用安装媒体的幻灯片。

Representative Results

，此处所描述的EMT诱导培养条件下提供一种可靠的方法用于诱导EMT的多种细胞类型中的图1和图2展示的形态学和标记物表达水平为4种不同的人细胞系：T98G胶质瘤细胞，HT29结肠腺癌细胞，A549肺癌细胞，并MCF10A乳腺上皮细胞。这是与EMT的诱导培养基添加剂处理过的细胞从传统的上皮形态（ 图1A – 1D）变更为间质，纺锤状形态（ 图1E – 1H）。 EMT诱导的细胞似乎不太密集的排布紧密的殖民地相比，未诱导的细胞。未诱导MCF10A样本含有由多个松散的细胞包围排列紧密的集群。这些紧凑团簇的E-cadherin蛋白阳性（ 图2D），消失在治疗EMT的诱导培养基增刊键相（ 图2H）。 EMT还评估了上皮标记和间质标记物的表达上调下调。 E-cadherin表达的下调通常观察到在不同的细胞类型3,4以下的EMT诱导图2展示了E-cadherin蛋白的表面表达在大部分未经处理的细胞（ 图2A – 2D，红色）。相比，它的缺席后EMT的诱导（ 图2E – 2H;红色）。一个细胞系，T98G，发现有E-cadherin的前EMT的诱导，这排除了其分析的一个非常低的基础水平。间充质标志物，纤维连接蛋白的上调，也可见诱导EMT的诱导培养基添加剂（ 图2A – 2D与图2E – 2H;绿色）之后。 E-钙粘蛋白和纤维连接蛋白的表达水平见过用免疫细胞化学通过总细胞裂解物的蛋白质印迹（ 图3）被进一步证实。免疫印迹证实E-cadherin蛋白和纤维连接蛋白的表达看到的免疫细胞化学的上调下调。该乐队是用密度和标准化为GAPDH，以确定相对倍数变化下的EMT诱导定量。 ，E-cadherin蛋白水平分别降低6.4和3.4倍，在A549和MCF10A细胞分别。纤连蛋白水平增加4.6，4.1和2.3倍，T98G，A549，和MCF10A细胞。虽然印迹不显示在HT29细胞后诱导EMT显著减少E-钙粘蛋白的水平，该免疫细胞化学结果表明在E-钙粘蛋白（ 图2B与2F），这是无法在加以区别的表面表达减少总细胞裂解物的免疫印迹。 为了进一步评估EMT的状态，其他已知的标记S代表EMT分析前和后的EMT诱导。与以前的结果，E-cadherin的表达下调在检查了所有的细胞系，这表明EMT的诱导。此外，间充质标志物，波形蛋白和蜗牛，以下的处理与EMT诱导培养基补充剂（ 图4）被上调在A549，T98G，并MCF10A细胞。在HT29细胞系中没有显示出的这些间质标记物具有或不具有EMT诱导表达（数据未显示），这可能表明，这些细胞利用为EMT诱导替代途径。 尽管TGF-β是足以诱导EMT的某些细胞上下文7,8,9，其它细胞类型不完全去除了TGF-β14的响应。 MCF7人乳腺癌细胞和胰腺癌细胞系PANC-1人胰腺癌细胞中都报道不向TGF-β的单独信令14作出响应。要确定是否这两条线可能在VITR经历EMTO，细胞培养的EMT诱导培养基添加剂的存在。细胞用重组单独TGF-β1，在EMT诱导培养基补充内的浓度。这些细胞保留了上皮形态，组成细胞的紧密包装的菌落（数据未示出）和表面的E-钙粘蛋白水平相似，看到在对照细胞（ 图5C和图5D与图5A和5B）。与此相反，细胞EMT的诱导培养基补充刺激呈现在表面E-cadherin蛋白水平的显着降低（ 图5E和5F）。这些细胞也得到更多的间充质的形态，如细胞变少紧凑和更纺锤状（数据未显示）。这些结果表明，这里所描述的EMT诱导方法能够促进EMT的形态，通常以TGF-β-I抗性标记物的表达变化在细胞EP3受体激动剂诱导的EMT。 除了改变标志物表达，间充质细胞的另一特点是他们的迁移和侵袭能力。迁移和侵袭的细胞具有或不具有EMT诱导培养基补充，根据制造商的说明使用96孔BME细胞侵袭测定，分析培养的。简言之，将细胞接种到96孔板（50,000细胞/孔）含有过滤器滤芯具有8.0微米的孔隙。 48小时后，迁移是由钙黄绿素在曾透过过滤器迁移细胞的AM染色评估。将每个样品一式三份，结果相似测试两次。从一个实验的代表性结果示于图6A中 。统计学显著增加（P值<0.003），在细胞迁移被认为与以下EMT诱导既A549和PANC-1细胞。为了评估这些细胞的侵入（ 即迁移至细胞外基质）的能力，在相同的测定是与基底膜提取物涂布的过滤器进行。 EMT诱导的细胞表现出统计学显著性（P值<0.001）增加侵袭能力相比，未经处理的细胞， 如图6B所示。 鲁棒诱导EMT的是用于基因表达的改变和信令发生在这些细胞中的分析是有用的。使用来自两个处理过的和未处理的细胞裂解物的基于抗体阵列分析是一种方法来分析单个样品的各种分子的表达水平。作为一个例子，我们分析的磷酸化MAPK家族成员的水平裂解物从非诱导的和EMT诱导的MCF7和A549细胞用蛋白质组探查人类磷酸化MAPK阵列试剂盒。该数组是从具有相似结果的独立的EMT诱导处理执行两次。 图7示出了从一个阵列的代表性数据。这两种类型的细胞表现出CREB（S133）的磷酸化增加，ERK1（T2 02/Y204）和ERK2（T185/Y187）在EMT诱导的细胞与对照组相比。在信号转导事件的差异两种细胞类型之间进行观察，以及。 A549细胞显示增加GSK-3β（S9）的磷酸化，而MCF7细胞呈增加的p70S6K（T421/S424）的磷酸化。 图1。刺激EMT的诱导培养基补充后的间充质形态感应（A – D）上皮的四个类型的细胞形态显示，连续5天在标准培养基不EMT的诱导培养基补充以下文化（E – H）。间充质的形态四种细胞类型的表示与EMT的诱导培养基补充培养5天。 NT“FO：保持together.within页=”总是“> 图2。上皮细胞标志物的表达，并在EMT诱导骨髓间充质细胞标志物表达的上调下调。细胞免疫荧光染色检测上皮标志物E-钙粘蛋白（红色）的表达，以及间质标记物，纤维连接蛋白（绿色）（A – D）控制细胞无EMT的诱导培养基补充培养5天（E – H）细胞的EMT的诱导培养基补充培养5天。所有细胞经DAPI染色（蓝色）。 图3。用免疫印迹的上皮细胞和间充质标志物表达的确认 。四个类型的细胞的总细胞裂解物的alysis Western印迹表明，与（EMT）或不处理（ – ）的EMT诱导培养基补充5天。频段的E-钙粘蛋白，纤连蛋白和GAPDH的装载控制是如左图所示。的大小标记物是，如右图所示。 图4。的间充质标志，波形蛋白和蜗牛在EMT诱导细胞上调。细胞的多色免疫荧光染色检测上皮标志物E-钙粘蛋白（灰色）的表达，以及间质标记，波形蛋白（绿色）和蜗牛（红） （A – C）控制细胞无EMT的诱导培养基补充剂培养5天。（D – F）细胞的EMT的诱导培养基补充培养5天。 lways“> 图5。诱导EMT的TGF-β1无响应的细胞。（A和B）的细胞与单媒体培养5天。（C和D）细胞在含TGF-β1的10毫微克/毫升，连续5天培养基。（E和F）中的EMT诱导培养基补充5天培养的细胞。所有的细胞被染色的E-cadherin的表达（红色）和经DAPI染色（蓝色）。 图6。 EMT诱导的细胞增加了迁移和侵袭能力。细胞培养后通过8微米孔径的过滤器，迁移48小时的A.平均数。的B.平均人数细胞能够通过侵入培养48小时后涂基底膜提取物8微米孔径的过滤器。误差棒表示超过3个孔的标准偏差。 EMT诱导的图7。基于抗体的阵列表达分析。从A549（A和C）裂解液和MCF7（B和D）细胞有或无的EMT诱导培养基培养补充被用于利用蛋白质组探查人类磷酸激酶试剂盒阵列阵列分析。 的景点，突出和 B，然后使用密度定量。未诱导EMT诱导裂解的比较显示在下面（C和D）中相应的柱状图。 点击这里查看大图</ A>。

Discussion

以前的方法诱导的EMT一般都用TGF-β刺激或遗传修饰。虽然单独的TGF-β已被证明是诱导EMT在一些细胞类型中，现已证实，TGF-β是必要的EMT的，但它不足以在所有细胞类型^6,14。使用遗传修饰为EMT诱导是耗时且劳动密集型的。这里描述的方法使用的因素，包括抗人E-钙粘蛋白，抗人SFRP-1，抗 – 人DKK-1，重组人的Wnt-5a和重组人TGF-β1能可靠地诱导EMT的组合。这些因素的组合的目的是阻止的E-钙粘蛋白为基础的粘合性，为EMT诱导⁴的一个关键步骤，并通过添加的Wnt-5a中的蛋白质，以及使用阻断抗体对Wnt信号的抑制剂增强Wnt信号传导，SFRP-1和DKK -1。 Wnt信号和TGF-β信号已被证明在自分泌环采取行动，以诱导和维持的间充质细胞统计E ^6。这个感应方法避免了遗传操作，并且比使用TGF-β的单独更有效。重要的是，我们能够观察到诱导EMT的细胞类型，包括MCF7和PANC-1细胞，先前已经证明不是完全响应的TGF-β刺激（ 图^5）14。

细胞的EMT诱导培养基补充节目少紧凑和增加纺锤状的形态（ 图1）处理。此外，还有减少表面的E-钙粘蛋白表达的并发与增加纤维连接蛋白的表达，这是EMT（ 图2和3）的标志。额外的间充质标记物如波形蛋白和蜗牛也上调了EMT诱导细胞相比，未诱导的对照（ 图4）。越来越多的迁移和侵袭能力的间充质细胞的主要功能特性。在体外 </em>迁移和侵袭测定法，与EMT诱导培养基补充处理的细胞表现出的迁移和侵入（ 图6）显著增加容量。

如使用图7中所示的抗体阵列表达数据表明了这一点为EMT诱导简单方法是EMT的信号传导的研究是有用的。不同类型的细胞可以比前和后的EMT诱导获得与EMT相关的共同表达特征，例如和ERK1 / 2可以看出在两个MCF7和A549的EMT诱导的细胞增加的磷酸化CREB的。 CREB的S133的磷酸化刺激DNA结合并已经显示出作用，TGF-β1-诱导的EMT ¹⁵的下游。 ERK1 / 2的磷酸化也被证明充当TGF-β1-诱导的EMT ¹⁶的下游。在信号通路中的细胞类型的不同，也可阐明看到，在A549细胞与p70S6增加GSK-3β的磷酸化ķ磷酸化在MCF7。 GSK-3β磷酸化的丝氨酸9减小它的功能，和GSK-3β激酶已被证明能够抑制亲EMT的转录因子，蜗牛^17。与此相反，p70S6K的诱导蜗牛的活性和它的磷酸化与活化该蛋白¹⁸的相关联。

总体而言，简单，可靠的诱导EMT的，特别是在先前表明不回应只对TGF-β细胞，是理解EMT的生物，确定共同的表达特征用作预后指标，以及开发和评估新的治疗癌症有用和纤维化疾病。

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Epithelial cells of interest			We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1
EMT Inducing Media Supplement	R & D Systems	CCM017
Recombinant Human TGF-β1	R & D Systems	240-B	Used at 10ng/ml
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody	R & D Systems	NL648R	Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry
Anti-E-Cadherin	R & D Systems	MAB1838	Used at 0.1 μg/ml for western blotting
Anti-Fibronectin	R & D Systems	MAB1918	Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting
Anti-GAPDH	R & D Systems	AF5718	Used at 0.2 μg/ml for western blotting
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody	R & D Systems	NL009	Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody	R & D Systems	HAF109	Used at 1:2000 for western blotting
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody	R & D Systems	HAF007	Used at 1:2000 for western blotting
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit	R & D Systems	SC026	Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.
96 Well BME Cell Invasion Assay	R & D Systems	3455-096-K	This kit was used according to the manufacturer’s recommendations.
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit	R & D Systems	ARY002B	This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19.
Mounting Media	R & D Systems	CTS011
0.4% Trypan Blue Solution	Life Technologies	15350-061
1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
95% Ethanol
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3311
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Triton-X-100	Roche Molecular Biochemicals	789-704	Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.
DAPI Solution	Sigma	D9542	Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.
Fine pointed curved forceps	Thermo-Fisher Scientific	08-875
12 mm coverslips	Carolina Biological	633009
Nonfat dry milk			Used at 5% in TBST for blocking in western blotting
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]			For western blotting blocking and washing
PVDF Membrane			For western blotting
4-20% SDS-page gel			For western blotting
ECL substrate			For western blotting
15 ml conical tubes
Plates/flasks, tissue culture treated
24-well plates, tissue culture treated
Pipettes / pipette tips
Pipet Aid / pipets
Hemocytometer
37 °C Water Bath
37 °C/5%CO2 Incubator
Centrifuge
Inverted light microscope
Fluorescence microscope