Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren
Summary
Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.
Abstract
Menselijke cellen niet onbeperkt vermenigvuldigen. Bij externe en / of extrinsieke factoren, kan cellen sterven of voer een stabiele celcyclus genoemd senescentie. Verschillende cellulaire mechanismen, zoals telomere verkorting en abnormale expressie van oncogenen mitogene, is aangetoond dat veroudering veroorzaken. Senescentie is niet beperkt tot normale cellen, kankercellen ook gerapporteerd senesce.
Chemotherapeutische geneesmiddelen is aangetoond senescentie induceren in kankercellen. Het blijft echter controversieel of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan van tumoren. Omdat het uiteindelijk misschien patiëntspecifieke, zal een snelle en gevoelige methode voor senescentie in kankercel beoordelen binnenkort nodig.
Daartoe de standaard β-galactosidase assay, de gebruikelijke methode nog voor grote nadelen: het is tijdrovend en ongevoelig. We stellen hier een doorstroomcytometrie-gebaseerde test senescentie op li bestuderenve cellen. Deze test heeft het voordeel dat snelle, gevoelige, en kan worden gekoppeld met de immunokleuring van verschillende cellulaire markers.
Introduction
Sinds begin jaren zestig en de ontdekking door Hayflick en Moorhead, veroudering blijft een cellulair nieuwsgierigheid 1. Menselijke cellen niet onbeperkt groeien en, door veroudering, Hayflick en Moorhead bedacht de cellulaire proces van veroudering. Senescentie is een stabiel celcyclus waarbij cellen metabool actief blijven in tegenstelling tot celdood. Tot op heden hebben vier cellulaire mechanismen aangetoond dat veroudering veroorzaken: telomeerverkorting, DNA-schade, chromatine verstoring, en abnormale expressie van mitogene oncogenen 2. Dit geeft aan dat niet alleen normale cellen maar ook kankercellen kunnen ondergaan senescentie 3. Als een zaak van de feiten, werden kankercellen ondergaan veroudering aangetoond dat een barrière voor verdere progressie van de tumor 4-5 vormen. Toch hebben verschillende rapporten nu op gewezen dat, onder bepaalde omstandigheden, kan cellulaire veroudering ook bevorderen maligniteit 6-7. Studeren veroudering van kanker cells is ongeveer om een drang in kankeronderzoek zoals momenteel gebruikte chemotherapeutische geneesmiddelen kan leiden tot veroudering van kankercellen niet alleen in vitro, maar ook in vivo 8 geworden.
De master assay te onderzoeken op de aanwezigheid van verouderde cellen is β-galactosidase assay bij zure pH. Dit histochemische test weerspiegelt de toegenomen lysosomale biogenese zich in de meeste verouderde cellen. Kort exogene X-gal, toegepast op cellen, wordt gesplitst door β-galactosidase verrijkt in lysosomen van verouderde cellen, waardoor een blauwe kleur 9. De blauwe verouderde cellen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd onder een helder veld microscoop. Hoewel zeer populair, de β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. Eerst wordt deze test uitgevoerd op gefixeerde cellen. Ten tweede is tijdrovend omdat het impliceert de mate van senescentie kwantificeren door telling significant groot aantal verouderde cellen onder een microscoop. Ten derde, het assayis niet gevoelig als de discriminatie tussen verouderde en niet-verouderde cellen vertrouwt volledig op de waarnemer.
We bespreken hier een onontgonnen, snelle en gevoelige cytometrie-gebaseerde test om te beoordelen op de aanwezigheid van levende verouderde cellen. Deze test is gebaseerd op de hydrolyse van een doorlatend membraan molecuul, de 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG C 12), door β-galactosidase verrijkt in verouderde cellen. Na hydrolyse en laser excitatie, de C 12 FDG zendt groene fluorescentie en derhalve worden gedetecteerd door flow cytometrie 10, 11. De detectie van verouderde cellen via flowcytometrie biedt het grote voordeel dat snelle en gevoelige. Bovendien kan detectie van verouderde cellen door flowcytometrie worden gekoppeld aan de detectie van andere cellulaire markers. Deze test kan worden gebruikt om verouderde cellen te detecteren in een populatie van kankercellen behandeld met chemotherapie en kan routinematig wordenup op weefselcoupes, na cellulaire dissociatie, in de kliniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteerde hier een flowcytometrie-gebaseerde methode om cellulaire veroudering in levende kankercellen te kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van het membraan permeabele stof, de C 12 FDG, en kan daarom worden gebruikt in een cel types en na verschillende behandelingen zolang de verbinding wordt opgenomen door de cellen. Bij cellulaire opname, de C 12 FDG gehydrolyseerd door β-galactosidase, verrijkt in lysosomen van verouderde cellen. Na laser excitatie, de verbinding ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de SF 4206 Icore (Universite de Caen) voor het gebruik van de cytometrie faciliteit. JC ontvangen post-doctorale beurzen van Conseil de radioprotectie d'EDF en de Conseil Regional van Basse-Normandie. Die gegevens waren onderdeel van gefinancierd door de Ligue Nationale contre le Cancer projecten – Comites de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
