Esame della<em> Drosophila</em> Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico
Summary
Qui, presentiamo un metodo per l'analisi al microscopio ottico di cellule terminali in tracheali<em> Drosophila</em> Larve. Questo metodo permette di rapido esame di ramo e lume morfologia in animali interi e sarebbe utile per l'analisi dei singoli mutanti o schermi per mutazioni che interessano lo sviluppo delle cellule del terminale.
Abstract
La forma delle cellule è fondamentale per la funzione delle cellule. Tuttavia, nonostante l'importanza della morfologia cellulare, poco si sa su come le singole cellule generano forme specifiche. Cellule terminali tracheali Drosophila sono diventati un potente modello genetico per individuare e chiarire i ruoli dei geni necessari per la generazione di morfologie cellulari. Cellule terminali sono una componente di una rete tubolare ramificata, il sistema tracheale che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni. Cellule terminali sono un ottimo modello per studiare questioni di forma delle cellule in quanto in possesso due architetture cellulari distinti. In primo luogo, cellule terminali hanno una morfologia ramificata elaborata, simile ai neuroni complessi, in secondo luogo, i rami terminali cellulari sono formate da tubi sottili e contengono un lume intracellulare di membrana. Analisi quantitativa di terminale numero ramo cella, organizzazione ramo e forma singola branca, può essere utilizzato per fornire informazioni sul ruolo di specifici meccanismi geneticocanismi nella realizzazione di una cella ramificata. Analisi di formazione del tubo in queste cellule può rivelare meccanismi conservate della tubulogenesi comuni ad altre reti tubolari, quali la vascolarizzazione vertebrato. Qui si descrivono le tecniche che possono essere utilizzate per risolvere rapidamente, immagine e analizzare sia i modelli di ramificazione e la formazione del tubo in cellule terminali all'interno di larve di Drosophila. Queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare cellule terminali in animali wild-type e mutanti, o mosaici genetici. A causa della elevata efficienza di questo protocollo, è anche adatto per la genetica, la base di RNAi, o schermi di droga nel sistema tracheale Drosophila.
Introduction
La forma delle cellule è critico per la funzione delle singole celle all'interno di un organismo, così come cellule che funzionano come parte di un tessuto o organo. Usiamo Drosophila cellule terminali tracheali, un componente del sistema respiratorio degli insetti, per indagare i meccanismi molecolari che partecipano al controllo di due tipi conservate della morfologia cellulare: ramificazione e di formazione del tubo (lumenogenesis). Cellule terminali sono situati alle estremità di una rete di tubi ramificati che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni 1 e hanno una morfologia ramificato elaborato che dipende da un FGF via di segnalazione che è controllato da livelli di ossigeno locale all'interno tessuti bersaglio 2. Rami di cellule terminali sono tubi sottili, con piene di gas lume subcellulari che attraversa ogni ramo. Le architetture cellulari distinti di cellule terminali, insieme con la facilità con cui l'analisi genetica può essere eseguita in Drosophila, rendono queste cellule un modello eccellente fo meccanismi di escrescenza cellulare investigare, ramificazione, e formazione del tubo intracellulare. Cellule terminali hanno dimostrato un modello utile per comprendere alcune delle vie di segnalazione che portano alla differenziazione delle cellule ramificate, escrescenza, e la maturazione 2-4. Utilizzando questo sistema imparziale, schermi avanti genetici per mutanti morfogenesi delle cellule sono stati eseguiti, cedendo intuizioni in meccanismi che controllano la forma delle cellule 5,6. Per esempio, questi schermi hanno rivelato che una RabGAP specifica è richiesta per la polarità del citoscheletro e il traffico delle vescicole in formazione di lumen e di posizionamento 7; che l'adesione integrine-mediata è necessario per la stabilità ramo 8, e che le proteine PAR-polarità epiteliali regolare il traffico di membrana polarizzata richiesto sia per ramificazione e formazione lumen 9. Altri studi in cellule terminali hanno dimostrato che è necessaria l'accumulo di actina asimmetrico e organizzazione dei microtubuli per l'allungamento delle cellule e lumenogenesis <sup> 10. Così, diversi meccanismi biologici, conservati cellule contribuiscono alla morfogenesi cellulare terminale.
Qui, descriviamo un metodo per risolvere rapidamente intatto terzo instar larve di Drosophila per l'analisi del terminale cellulare ramificazione e la formazione di lumen. Questo protocollo può anche essere eseguita su entrambi i primi e secondi animali instar. Chiave di questa tecnica è la capacità di visualizzare cellule terminali che sono geneticamente etichettati mediante espressione proteina fluorescente direttamente attraverso la cuticola larvale degli animali intatti. Dal momento che questa procedura non richiede manipolazioni post-fissazione, come colorazione degli anticorpi, di osservare le cellule, che ben si adatta ad analisi ad alta velocità, tra cui lo screening genetico o di droga. Espressione della proteina fluorescente rivela la struttura dei rami cytoplasmically-riempite. Formazione del tubo può essere monitorato in parallelo utilizzando microscopia brightfield per identificare il lume pieno di gas, che contrasta con il fluido circostante-fillndr tessuti.
Incluso in questo protocollo è il metodo per la generazione di mosaici genetici basati sul sistema MARCM 11, per la produzione di cellule terminali mutanti omozigoti marcati con proteine fluorescenti in animali altrimenti non etichettati. Ciò è necessario, poiché cellule terminali elaborano solo le loro strutture complesse relativamente tardi nello sviluppo; mosaici genetici consentono di bypass delle esigenze del gene in altri tessuti precedenti in sviluppo. . Per generare cloni marcm, trachea sono etichettati con il driver tracheale specifico fiato (btl) 12 qui descritto è il protocollo per il cromosoma X di Drosophila, per altri cromosomi, una procedura simile può essere utilizzato, con i reagenti genetica appropriata al cromosoma essere esaminato. Qui, trachea sono etichettati da espressione di una GFP cytoplasmically localizzata, ma la procedura funziona ugualmente bene con espressione di altre proteine fluorescenti, quali DsRed.
Inoltre, abbiamo incluso un metodo per quantificare modelli di ramificazione e la formazione di lumen in cellule terminali, sulla base di metodi sviluppati per la caratterizzazione di modelli neuronali 13 filiali. Questo tipo di dati quantitativi può essere critica nel discernere il ruolo preciso dei geni nel processo di ramificazione o lumenogenesis, oltre a permettere un confronto diretto tra diversi mutanti 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di fissazione di calore qui descritto è uno strumento rapido e conveniente per l'imaging Drosophila larvali cellule terminali tracheali. Qui, usiamo questa tecnica per esaminare la ramificazione e lume modello di cellule wild-type. Cellule tracheali esprimono GFP, guidato dal promotore specifico tracheale senza fiato, possono essere facilmente visualizzati attraverso la cuticola larvale dopo la fissazione di calore. Gli specifici modelli di ramificazione di cellule terminali individuali…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Gillian Stanfield per i commenti sul manoscritto. TAJ è sostenuto dalla University of Utah Genetica formazione di Grant T32-GM007464 dal NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
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