Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas
Summary
En esta publicación, se describe un procedimiento rápido y conveniente para el aislamiento y cultivo de las células acinares pancreáticas primarias del páncreas murino. Este método constituye un enfoque valioso para el estudio de la fisiología de las células pancreáticas exocrinas normales / no transformada primarios frescos.
Abstract
Este protocolo permite el aislamiento rápido (en menos de 1 hora) de acinos pancreáticos murino, por lo que es posible mantener en cultivo durante más de una semana. 10 6 células acinares Más de 20 x puede obtenerse a partir de un único páncreas murino. Este protocolo ofrece la posibilidad de procesar de forma independiente hasta 10 páncreas en paralelo. Debido a que preserva la arquitectura acinar, este modelo es muy adecuado para el estudio de la fisiología del páncreas exocrino in vitro en contraste con las líneas celulares establecidas a partir de tumores de páncreas, que muestran muchas alteraciones genéticas que resultan en la pérdida parcial o total de su diferenciación acinar.
Introduction
Un problema frecuente para los laboratorios de investigación que trabajan en tejido pancreático exocrino es la dificultad de cultivar las células acinares in vitro durante un periodo de tiempo suficientemente largo para permitir que un experimento a largo plazo.
Un factor que impide el desarrollo de estos sistemas de cultivo es la sensibilidad intrínseca del tejido pancreático a la manipulación experimental, debido al alto contenido de enzimas glucolíticas, proteolítica y lipolítica, que literalmente digerir el tejido pancreático cuando se liberan durante el aislamiento de las células pancreáticas.
Un segundo factor es la notable en la plasticidad in vitro de las células acinares, que tienden a perder sus características de secreción y transdifferentiate a otras células maduras, tales como células ductales pancreáticas o células de hepatocitos como 1. In vitro, esta plasticidad de las células varía con las condiciones experimentales (tales como composición del medio de cultivo) 2 </sup> e introduce un grado de complejidad en el diseño de las condiciones de cultivo apropiados para las células pancreáticas exocrinas 1.
Varios métodos han sido desarrollados para el aislamiento y cultivo de células acinares, primero desde el páncreas conejillo de indias 3-5. Inicialmente, los protocolos involucrados digestión de tejido pancreático con colagenasa, quimotripsina, y un cóctel de proteasa, con el aislamiento final por disociación mecánica vigorosa. Las células pancreáticas aisladas de esta manera muestran características estructurales y funcionales anormales, en particular una pérdida de estructuras apicales y daños significativos a sus receptores de membrana. Las células aisladas se mantuvieron viables sólo 1 ó 2 días.
Preparación de acinos dispersa mantiene su arquitectura intra-e intercelular, la preservación de las membranas celulares, lo que limita el daño a receptores de la superficie, y por lo tanto la mejora de la secreción exocrina en respuesta a secretagogos de 6-8. Como resuLT, este método ofrece la importante ventaja de extender la viabilidad celular acinar a 7-10 días in vitro. Por otra parte, actualmente se prefiere este método de aislamiento de células acinares 9-12 porque el mantenimiento de los contactos intercelulares, incluyendo acoplamiento celular por uniones, es un determinante esencial de la exocrina pancreática acinar fenotipo celular 13.
A medida que la desdiferenciación de las células acinares y su transdiferenciación de células ductales es uno de los mecanismos propuestos para la génesis de los cánceres de páncreas exocrino agresivos 14, el modelo de acinos dispersa es también un sistema adecuado para estudiar la plasticidad pancreática y sus mecanismos moleculares subsiguientes. Además, en combinación con el uso de animales modificados genéticamente 15,16 y el desarrollo de técnicas de transferencia de genes (adenoviral 2 o transducción lentiviral, el uso de las nanopartículas, etc), en este modelo de células acinares primaria in vitro puedeser muy útil en la determinación de cómo diversas disfunciones genéticas afectan la regulación de la diferenciación de células acinares o desdiferenciación y deberían proporcionar una mejor comprensión de los eventos moleculares responsables de la aparición de la pancreatitis, lesiones precancerosas, y los cambios en la plasticidad de las células.
El aislamiento de los acinos dispersa es el enfoque que usamos en nuestro laboratorio con las células acinares pancreáticas cultura. Se describen y discuten el método utilizado. Se trata de la disociación enzimática de tejido pancreático (con una colagenasa bacteriana) acoplado a la disrupción mecánica sin la disociación de las células acinares. Aunque la mayoría de protocolos implican el cultivo de la acinos, en suspensión o en sustratos de plástico especialmente tratadas, les crecen en suspensión sólo brevemente (durante 24 horas), sembrando en ellos después andamios matriz si se requiere cultivo celular prolongado.
Este protocolo permite el aislamiento rápido (en menos de 1 hora) de la dispersión de páncreas de corriente alternaini, sostenible desde hace más de una semana en la cultura. Se permite el aislamiento de más de 20 x 10 6 células acinares por páncreas de ratón. Su simplicidad hace que sea posible procesar de forma independiente un máximo de 10 páncreas en paralelo. Mediante el mantenimiento de la arquitectura intra e intercelular de los acinos y por lo tanto el fenotipo de las células acinares primarias aisladas, este modelo constituye un sistema de elección para el estudio de los mecanismos de transdiferenciación, como todos los otros modelos pancreáticas exocrinas actualmente disponibles se derivan de los tumores pancreáticos se presentan muchos genética alteraciones que conduce a la transformación celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe un procedimiento para el aislamiento de células acinares pancreáticas. Este método hace posible aislar más de 20 x 10 6 células acinares por animal en menos de 1 hora. Gracias a su rápida y fácil aplicación (hasta 10 páncreas se pueden procesar de forma independiente por experimento en paralelo), este protocolo aparece como un buen compromiso entre los métodos de aislamiento existentes 3-5,9-12,17.
Los pasos críticos / Local…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias al personal de Anican (CRCL, Lyon) por su asistencia técnica con el cuidado animal. Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Programa Avenir INSERM), la Ligue Nationale Contre le Cancer, por la Association pour la Recherche sur le Cancer, por el Instituto Nacional del Cáncer, y por becas de la Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), del Instituto Nacional del Cáncer (JG), del Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche de Francia (RMP y DFV) y de la Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
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