Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ricombinanti
Summary
Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene contenente<em> Agrobacterium tumefaciens</em> In impianti per la proteina espressione transitoria.
Abstract
Colture cellulari di mammifero è la più importante piattaforma per la produzione commerciale di vaccini umani e delle proteine terapeutiche. Tuttavia, non può soddisfare la crescente domanda mondiale di prodotti farmaceutici grazie alla sua scalabilità limitata e costo elevato. Le piante hanno dimostrato di essere una delle più promettenti alternative piattaforme di produzione farmaceutica che sono robuste, scalabili, a basso costo e sicuro. Il recente sviluppo di vettori basati sul virus ha permesso rapida e di alto livello di espressione transiente di proteine ricombinanti in piante. Per ottimizzare ulteriormente l'utilità del sistema di espressione transiente, dimostriamo una metodologia semplice, efficiente e scalabile per introdurre target-gene contenente Agrobacterium in tessuto vegetale in questo studio. I nostri risultati indicano che agroinfiltration sia con siringa e vuoto metodi hanno portato alla introduzione efficiente di Agrobacterium in foglie e produzione robusta di due proteine fluorescenti, GFP e DsRed. Inoltre,dimostriamo i vantaggi unici offerti da entrambi i metodi. Siringa infiltrazione è semplice e non richiede attrezzature costose. Esso permette anche la flessibilità di entrambi infiltrare l'intero congedo con un gene bersaglio, o per introdurre geni di bersagli multipli su un unico foglio. Quindi, può essere utilizzato per l'espressione scala di laboratorio di proteine ricombinanti e per confrontare diverse proteine o vettori di espressione yield o cinetica. La semplicità della siringa infiltrazione suggerisce anche la sua utilità nella scuola superiore e l'istruzione universitaria per il soggetto delle biotecnologie. Al contrario, l'infiltrazione di vuoto è più robusto e può essere scalata-up per la produzione commerciale di proteine farmaceutiche. Esso offre anche il vantaggio di poter agroinfiltrate specie vegetali che non sono suscettibili di infiltrazione siringa come lattuga e Arabidopsis. Nel complesso, la combinazione di siringa e agroinfiltration vuoto fornisce ai ricercatori ed educatori un semplice, efficiente e robustometodologia per l'espressione proteica transiente. Esso agevolerà notevolmente lo sviluppo di proteine farmaceutiche e promuovere l'educazione scientifica.
Introduction
Dal 1970, le piante sono state esplorate come alternative alle colture cellulari di mammifero, insetto, e batteriche per la produzione commerciale di proteine ricombinanti e proteine terapeutiche 1. Sistemi a base vegetale per l'espressione di biofarmaci hanno mostrato risultati promettenti negli ultimi anni come molti nuovi trattamenti per le malattie, come il morbo di Gaucher 2, e l'influenza aviaria H5N1 3, hanno dimostrato il successo negli studi clinici. Lo sviluppo di meccanismi competenti per l'espressione di proteine ricombinanti nelle piante nei decenni successivi gli esperimenti iniziali ha creato il potenziale per i sistemi a base di piante per alterare l'attuale paradigma di produzione di proteine per tre motivi principali. In primo luogo, vi è una notevole diminuzione dei costi come bioreattori mammiferi, insetti e batteri richiedono notevoli costi di avvio, i media di crescita costosi e complicati processi di depurazione a valle 4. La creazione di pianta transgenica stabilelinee permette loro anche di surclassare la scalabilità di altri sistemi di espressione di proteine come le piante che esprimono possono essere coltivate e raccolte su scala agricola 5. In secondo luogo, sistemi di espressione a base vegetale riducono significativamente il rischio di trasmissione di un patogeno umano o animale dall'host proteina-esprimendo agli esseri umani, dimostrando superiorità nella pubblica sicurezza 6. Infine, impianti utilizza un sistema eucariotico endomembrane che è simile alle cellule di mammifero, permettendo una corretta modificazione post-traduzionale di proteine compreso glicosilazione e l'assemblaggio delle proteine multiple-subunità 7. Questa capacità pone sistemi a base vegetale avanti di quelli basati su sistemi procariotici, come batteri, poiché un numero più ampio di proteine ricombinanti farmaceutiche, inclusi anticorpi monoclonali (mAb), hanno una struttura più complessa e richiedono ampie modifiche post-traduzionali o da montaggio 8.
Ci sono due principali approdolori ad esprimere proteine ricombinanti nelle piante. Il primo è lo sviluppo di una linea transgenica stabilmente, in cui il DNA codificante per la proteina bersaglio viene clonato in una cassetta di espressione e introdotto sia ad genomi nucleari o cloroplasto. Così facendo, il DNA estraneo diventa ereditabile attraverso successive generazioni e consente enormemente migliorata scalabilità, ben oltre quella di altri sistemi di espressione 1. Introduzione di DNA esogeno al genoma nucleare è di solito realizzato da Agrobacterium tumefaciens infezione del tessuto vegetale o, meno spesso, da microproiettili bombardamento del tessuto 9. Ormoni vegetali sono poi utilizzati per indurre il differenziamento e la crescita di tessuto vegetale transgenica come radici e foglie. Trasformazione del genoma del cloroplasto non può essere raggiunto con A. tumefaciens, ma si basa interamente su particelle di oro o di tungsteno rivestite di DNA sparato balisticamente nelle cellule vegetali. Il secondo metodo di esprimere ricombinazionent proteina nelle piante è attraverso l'espressione transiente 10. In questo scenario, vettori derivati da virus ospitano il gene di interesse sono consegnati via A. tumefaciens di piante completamente sviluppate attraverso un processo chiamato agroinfiltration. Invece di integrare nel genoma della pianta, il costrutto genico espresso inizierà a dirigere la produzione transiente della proteina desiderata, che può essere raccolto e isolato dopo un breve periodo di incubazione. Espressione genica transiente offre il vantaggio di una maggiore accumulo di proteine generale così come un tempo maggiore di produzione di proteine, come piante saranno pronte raccogliere circa 1-2 settimane dopo agroinfiltration 11. Questo è significativamente più veloce rispetto ai processi di generazione, la selezione e la conferma delle linee di piante transgeniche stabili, che può richiedere diversi mesi a un anno. Questo però, è anche la limitazione del sistema di espressione transiente, in quanto non produrrà geneticamente stabile pianta lines che possono essere utilizzati per generare una banca di seme per la produzione commerciale su larga scala. Nonostante questo, sono stati sviluppati approcci per migliorare larga scala espressione transiente. Qui mostriamo un metodo di generazione di proteine che esprimono piante di Nicotiana benthamiana transitori utilizzando vettori virali decostruiti consegnati da A. tumefaciens.
Due metodi principali sono in sviluppo per la fornitura di A. tumefaciens in tessuto vegetale: panchina scala infiltrazione tramite siringa e infiltrazione larga scala tramite camera a vuoto. Entrambi i protocolli sono descritti usando N. benthamiana, che è strettamente legato alla pianta del tabacco comune, come la pianta ospite per l'espressione transiente di due proteine fluorescenti: la proteina fluorescente verde (GFP) dalle meduse Aequorea victoria e la proteina fluorescente rossa da Discosoma corallo (DsRed) 12,13. N. benthamiana è la pianta ospite più comune per laproteina ricombinante perché è suscettibile di trasformazione genetica, può produrre elevate quantità di biomassa rapidamente, ed è un produttore di seme prolifico per la produzione su scala industriale 14. Un altro vantaggio di usare N. benthamiana come ospiti per l'espressione proteica è la disponibilità di una varietà di vettori di espressione 2,5. In questo studio, i due vettori virali decostruiti, uno basato su un virus del mosaico del tabacco (TMV) RNA sistema replicone (vettori MagnICON) e l'altro derivato dal virus del nanismo giallo fagiolo (BeYDV) sistema replicone DNA (vettori geminiviral) 4,11, 15-18, sono utilizzati per trasportare il gene GFP e DsRed e consegnarli in N. cellule benthamiana via A. tumefaciens. tre costrutti di DNA saranno utilizzati per la GFP o espressione DsRed con vettori MagnICON. Essi comprendono 'modulo (pICH15879) contenente il promotore ed altri elementi genetici per guidare l'espressione del gene bersaglio, il 3' del modulo 5 contenente il gene di interesse (Pich-GFP o PICH-DsRed), e il modulo integrasi (pICH14011) codifica per un enzima che integra il 5 'e 3' insieme moduli sull'espressione 8,15. Sono necessari anche tre costrutti di DNA per l'espressione con vettori geminiviral. Oltre a vettori contenenti il replicone del gene target (pBYGFP o pBYDsRed), è richiesto un vettore codificante per la proteina di replica (pREP110) per l'amplificazione del target replicone 11,14,16. Inoltre, l'inserimento di un vettore codificante il tacere soppressore p19 del virus del rachitismo cespuglioso pomodoro è desiderato per il livello di espressione del gene target alto 11,16.
Ci sono generalmente tre fasi principali per l'introduzione di geni di proteine ricombinanti in cellule vegetali per agroinfiltration compresi crescita delle piante, A. tumefaciens cultura preparazione, e infiltrazione. Come ogni passaggio è fondamentale per il successo finale di questa procedura, quindi, una descrizione dettagliata per ognuno è fornitosia per infiltrazione siringa e vuoto infiltrazione sotto.
Protocol
Representative Results
Discussion
La crescente domanda di prodotti farmaceutici a base di proteine a livello mondiale richiedono nuove piattaforme di produzione che sono robusti, scalabili, a basso costo e sicuro. Piante hanno dimostrato di essere uno dei sistemi di produzione alternativi più promettenti per la produzione di proteine farmaceutiche. Negli ultimi anni, lo sviluppo di vettori basati sul virus destrutturati ha consentito espressione transiente di proteine nelle piante, che migliora notevolmente la velocità e la resa dei …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo R. Sun e altri studenti del Laboratorio di Chen per il loro contributo alla centrale di generazione di materiale. Ringraziamo anche il Dott. D. Green per il suo sostegno alla ricerca di laurea presso la Facolta 'di tecnologia e l'innovazione (CTI). Questa ricerca è stata sostenuta in parte da sovvenzioni NIH U01 AI075549 e 1R21AI101329 al D. Chen, e una borsa di SSE da CTI della Arizona State University di Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, e J. Stahnke sono studenti universitari finanziati dalla sovvenzione SSE.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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