Многомасштабных Модификация металлических имплантатов с поры градиенты, полиэлектролитов и их косвенного мониторинга<em> В естественных условиях</em
Summary
В этом видео мы покажем, модификации техники для пористых металлических имплантатов для улучшения их функциональности и контролировать миграцию клеток. Методы включают развитие пор градиенты контролировать движение клетки в 3D и производство базальной мембраны имитирует контролировать движение клетки в 2-D. Кроме того, ВЭЖХ, метод на основе мониторинга интеграции имплантата в естественных условиях с помощью анализа крови белков описано.
Abstract
Металлические имплантаты, особенно титановые имплантаты, которые широко используются в клинической практике. Ткань в-рост и интеграцию этих имплантатов в тканях являются важными параметрами для успешных клинических исходов. Для того чтобы улучшить ткани интеграции, пористые металлические имплантаты в стадии разработки. Открытая пористость пены металлического очень выгодно, поскольку площадей пор может быть функционализированные без ухудшения механических свойств всей конструкции. Здесь мы опишем такие модификации использованием пористых имплантатов на основе титана на микрошариках титана. При использовании присущие физические свойства, такие как гидрофобность титана, можно получать гидрофобный пор градиенты внутри микрошариков на основе металлических имплантатов и в то же время иметь базальной мембраны имитируют основе гидрофильных, природных полимеров. 3D пор градиенты образуются синтетические полимеры, такие как поли-L-молочной кислоты (PLLA) сублимационной экстракции. 2D nanofibrillar SurЛица сформирован с использованием коллаген / альгинат последующей стадии сшивания с естественным сшивающего агента (генипин). Этот фильм nanofibrillar была застроена слой за слоем (LbL) метод осаждения из двух противоположно заряженных молекул, коллаген и альгинат. Наконец, где имплантат различных областях можно разместить различные типы клеток, так как это необходимо для многих многоклеточных тканей, могут быть получены. По, таким образом клеточный движение в различных направлениях на различные типы клеток можно контролировать. Такая система описана для конкретного случая трахеи регенерации, но она может быть изменена для других органов-мишеней. Анализ миграции клеток и возможные методы для создания различных градиентов пор разрабатываются. Следующим шагом в анализе таких имплантатов является их характеристика после имплантации. Тем не менее, гистологический анализ металлических имплантатов является длительный и трудоемкий процесс, таким образом, для мониторинга хостов реакцией на металлические имплантаты в естественных условияхlternative метод, основанный на мониторинге CGA и различных белков крови также описано. Эти методы могут быть использованы для разработки в пробирке заказ миграции и колонизации тесты, а также быть использованы для анализа функционализированной металлические имплантаты в естественных условиях без гистологии.
Introduction
В настоящее время доступны металлических имплантатов являются подходящими для несущих приложений, но их не-разложению требует конструкции, которые обеспечивают сильное взаимодействие с тканью, окружающей их 1. Предоставляя структур, которые способствуют сотовой в росте и колонизации в живом организме, срок службы металлических имплантатов может быть продлен 2. Открыто пористых металлических имплантатов являются перспективными материалами для тканевой инженерии интерфейс, а также для обеспечения хорошей колонизации имплантатов. Они активно используются в качестве ортопедических имплантатов, а также как трахеи имплантаты 3-5. Тем не менее, все еще существуют проблемы, которые необходимо решить такие как точный контроль клеточного движения в порах областях. Неспособность контролировать этот процесс может привести к неполному колонизации на одном конце и рестеноза в другом. Кроме того, дальнейшее функционализации этих имплантатов необходимо для достижения более высоких функций, таких как, доставка факторы ростанаправленный васкуляризации и одновременное перемещение различных типов клеток 6-8. Для трахеи имплантатов, это очень важно, поскольку колонизация имплантат тканях васкуляризированной желательно. Тем не менее, неконтролируемый ткани роста в просвете трахеи является нежелательным, поскольку оно уменьшает имплантат проходимости.
Одна из возможностей для контроля клеточного движения является гель. Зная размер клеток-мишеней и их способности взаимодействовать с данным синтетического полимера можно разработать градиенты поры, которые могут эффективно определять глубину клеточного движения. Например, создав пор архитектуру, которая является достаточно большим для ввода клетки соединительной ткани, таких как фибробласты extraluminally, но достаточно малым (менее 10 мкм), чтобы предотвратить их перемещение intraluminally эффективный контроль за колонизацию трубчатого имплантата может быть достигнута.
Из доступных пор методы создания такого как замораживание-dryiнг, частицы выщелачивание, газ вспенивание 9,10; простой адаптировать метод быстрого формирования пор градиенты с минимальным количеством необходимого оборудования вымораживанием экстракции 11. В этом методе полимерный раствор замораживают в бинарной смеси органического растворителя и воды. После этого растворитель, обмен через экстракции смешивается предварительно охлажденной жидкости, такой как этанол. Замораживание и условий экстракции определения формы и размера пор и, если экстракцию проводят таким образом, где движение экстракционного раствора можно контролировать, размера и формы пор может быть направленно модулированный.
Второй шаг за многоклеточных тканей является формирование пористых барьеров между разными типами клеток контролировать их взаимодействии. Это также необходимо для наличия различных микросреды для различных типов клеток в зависимости от их требований 12,13. Трахеи трубчатый орган, соединяющий гортань с bronchя. Он имеет внутреннюю подкладку псевдомногослойного цилиарного эпителия с interdispersed кубок клетки, которые продуцируют слизь. 3D структуры и стабильности трахеи поддерживается хрящ в форме С-кольца. Таким образом, в искусственной трахеи должна быть определена соединения между соединительной ткани и цилиарного эпителиальный слой. В то время как 3D структура является необходимым для соединительной частью ткани, миграцию эпителиальных клеток требует базальной мембраны, как поверхность для достижения направленного движения и закрытия раны. Полиэлектролитные многослойных пленок (ФЭУ) являются одним из возможных вариантов для получения мимика базальной мембраны. Слой за слоем методом (LbL) представляет собой универсальный процесс получения тонких и функциональных покрытий поверхности. Он основан на электростатические взаимодействия двух противоположно заряженных полиэлектролитов и их наращивание в последовательном порядке для получения наноразмерных покрытий поверхности, свойства которого можно изменять путем простого изменения переменных, таких как виды полиэлектролитов, рН,номер слоя, добавление укупорки слой, сшивающие и т.д. Одним из основных преимуществ LbL способа является его способность соответствовать топографии нижележащей подложки. Таким образом, при контролируемых условиях этот способ также можно использовать для получения покрытия поверхности пористых структур. Если коллаген используется в качестве одного из полиэлектролиты можно получить nanofibrillar структур, которые могут имитировать поверхности базальной мембраны. Гидрофобность титана позволяет развитие таких структур и fibrillarity может быть сохранена в толстых покрытий 14. Таким образом, крепление и движение клетки на поверхности может также управляться. С помощью сублимационной добычи и LbL пленочное покрытие последовательно структуру, в которой движение клетки можно управлять сбоку в продольном и окружном может быть получена 15.
Здесь мы рассмотрим два новых методов модификации для титановых имплантатов, используя свои гидрофобные поведение, которое может бытьраспространяется на модификации различных пористых имплантатов: а) формирование градиентов микропор в макропористой титановых имплантатов с гидрофобными, синтетические полимеры II) формирование толстого полимерный слой пленки на поверхности имплантата, который поддерживает рост клеток и формирование подкладка по полиэлектролитных слоев. Эти методы могут быть использованы последовательно или раздельно. Они обеспечивают структур, которые обеспечивают контролируемое миграции и пространственной организации различных типов клеток в многоклеточных тканей 16,17. В конкретном случае трахеи, желаемый результат для имплантата будет колонизации сосудисто-волокнистых тканей внутри микропор градиенты без рестеноза и формирования внутренней оболочки ресничных эпителиальных клеток на полиэлектролитных слоев.
Один из способов управления интеграции имплантатов делать небольшие хирургические вмешательства в период их интеграции с принимающим на месте. Для того, чтобы быть в состоянии тØ решение о сроках проведения мероприятия, важно иметь информацию о системных эффектов имплантата. С-реактивный белок (CRP) был использован для мониторинга инфекции и воспалительные реакции в клинических условиях. Хромогранин (CGA) также может быть использован таким же образом и может обеспечить более точные результаты для наблюдения за уровнем воспаления 18. В качестве возможного способа наблюдения металлических интеграции имплантата в естественных условиях, мы представляем процедуры непрерывного мониторинга системных эффектов имплантатов по характеристике животного образцов крови с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и последующего секвенирования белка. Разработка этот метод может быть использован, чтобы избежать регулярных конечной точки гистологического анализа. Гистологическое порезки металлических имплантатов является длинным, громоздким и дорогостоящим процессом и могут быть предприняты только в определенные моменты времени. Именно по этой причине, хорошо продуманные крови обеспечения надежной информации о здоровье имплантат будетМожно маршрутов для уменьшения экспериментов на животных в соответствии с мандатом с последними нормативами ЕС относительно экспериментов на животных.
Методы, представленные здесь, могут быть использованы для улучшения производительности металлических имплантатов через функционализации или иметь альтернативный способ мониторинга существующих имплантатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пора градиенты являются важными инструментами в интерфейс тканевой инженерии и системы, описанной здесь, могут быть использованы отдельно или в сочетании с металлическими имплантатами, чтобы сформировать пор градиент для изучения миграции клеток. Система не требует каких-либо допол?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Андре Walder и Николя Перрен для производства титановых имплантатов, К. Benmlih для наращивания Формы тефлона и д-р Г. Прево за помощь в экспериментах на животных. Мы также признаем региона Эльзас и PMNA (полюс Materiaux ET нанонаукам d'Alsace) для финансового взноса.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O’Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid – liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization – Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid – liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -. M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
