Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen
Summary
Hier laten we zien hoe beeldcytometrie kan worden gebruikt voor kwantificering van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen in kweek. Deze techniek kan worden gebruikt als alternatief voor CFU opsomming.
Abstract
Studies van de cellulaire mechanismen van de pathogenese van pathogene gisten zoals Candida albicans, Histoplasma capsulatum, en Cryptococcus neoformans algemeen gebruik infectie van zoogdierlijke gastheren of gastheercellen (bijvoorbeeld macrofagen), gevolgd door gist kwantificering middels kolonievormende eenheid analyse of flowcytometrie. Terwijl kolonievormende eenheid opsomming is de meest gebruikte methode op het, deze techniek heeft nadelen en beperkingen, waaronder trage groei van sommige schimmelsoorten op vaste media en lage en / of variabele plating efficiëntie, hetgeen vooral van belang bij het vergelijken van de groei van wild-type en mutante stammen. Flowcytometrie kan snelle kwantitatieve informatie over de levensvatbaarheid van gist te voorzien, echter de goedkeuring van flowcytometrische detectie van pathogene gisten is beperkt tot een aantal praktische redenen, waaronder de hoge kosten en bioveiligheid overwegingen. Hier laten we zien een beeld-gebaseerdecytometrische methode met behulp van de Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) voor de kwantificering van levensvatbare pathogene gisten in co-cultuur met macrofagen. Onze studies richten zich op de opsporing van twee menselijke pathogene schimmels: Histoplasma capsulatum en Candida albicans H.. capsulatum koloniseert alveolaire macrofagen door repliceren binnen de macrofaag phagosome, en hier, we kwantitatief de groei van H. te beoordelen capsulatum gisten in RAW 264,7 macrofagen met acridine oranje / propidiumjodide kleuring in combinatie met beeldcytometrie. Onze methode trouw recapituleert groei trends zoals gemeten volgens de traditionele kolonievormende eenheid opsomming, maar met aanzienlijk verhoogde gevoeligheid. Daarnaast hebben we direct beoordelen infectie van levende macrofagen met een GFP-expressie stam van C. albicans. Onze methodologie biedt een snelle, accurate en economische middelen voor detectie en kwantificering van belangrijke menselijke schimmels in associatie with gastheercellen.
Introduction
Studies van pathogene schimmels in samenwerking met hun gastheren en / of gastheercellen vereisen vaak kwantificering van levensvatbare schimmels cellen over een tijdsverloop of onder verschillende omstandigheden infectie. Bepalen van kolonie vormende eenheden (CFU) is de standaard methode waarbij het aantal levensvatbare schimmelcellen is gemeten, maar deze techniek heeft een aantal nadelen en beperkingen. Ten eerste, veel schimmelsoorten groeien langzaam. Groei van zichtbare kolonies op vaste media kan 1-2 weken duren, aanzienlijk vertragen van het tempo van het onderzoek. Tweede, manipulatie van monsters tijdens CFU plating is een moeizaam proces, aangezien verschillende verdunningen moeten worden uitgeplaat op een aftelbaar aantal kolonies garanderen. Ten derde, het aantal CFU doorgaans lager is dan het aantal levensvatbare organismen uitgeplaat omdat de plating efficiëntie ruim onder 100%. Bijvoorbeeld kan plateren efficiëntie voor de dimorfe schimmel pathogeen Histoplasma capsulatum oplopen tot 90%, maar gewoonlijk zo laag als30% en zelfs lager (10%) voor de verbonden schimmel dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating efficiency voor Candida albicans is ook onderhevig aan variabiliteit 3. Tenslotte CFU analyse slechts verantwoordelijk voor levende en actief delende cellen kunnen vormen van de groei op vaste media, terwijl in veel situaties, zou het nuttig zijn om de aanwezigheid en concentratie van dode en / of metabolisch inactieve cellen te bepalen.
Eerder heeft flowcytometrische werkwijzen voor kwantificering van verscheidene pathogène schimmelsoorten beschreven 4-6. Echter, vanwege de bioveiligheid insluiting kwesties die met behulp van bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) of BSL3-niveau ziekteverwekkers op gedeelde flowcytometers, goedkeuring van deze techniek is beperkt. Zoals flowcytometrie, beeldcytometrie is een gevoelige en snelle methode van cel kwantificering. Echter, beeldcytometrie worden uitgevoerd bij een fractie van de kosten met vergelijkbare resultaten 7 –11. We beschrijven hier werkwijzen voor het uitvoeren beeldcytometrie van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen. We tonen onze methoden met behulp van twee menselijke pathogene schimmels: Histoplasma capsulatum en Candida albicans H.. capsulatum is een dimorphic schimmelziekteverwekker dat respiratoire aandoeningen veroorzaakt, bij de mens, het groeit als gist en repliceert binnen alveolaire macrofagen Candida albicans is een humane commensale soorten die soms veroorzaakt candidiasis.. We laten zien dat beeldcytometrie maakt een snelle kwantificering van deze gisten, samen met visualisatie mogelijkheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beeldcytometrie kan de gebruiker hoge kwaliteit beelden vast te leggen en, met behulp van gespecialiseerde software voert snelle kwantificering van cellen. Een mogelijke uitdaging voor de vaststelling van beeldcytometrie op het gebied van microbiële pathogenese is dat de microben te tellen aanwezig in een gemengde populatie van cellen, waaronder zoogdierlijke gastheercellen. Hier tonen wij dat beeldcytometrie kan worden gebruikt voor de kwantificering van levensvatbare pathogène gist in macrofagen in vitro in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
