Summary
在这里，我们将演示如何图像流式细胞仪可用于量化致病真菌与宿主细胞培养。 CFU枚举作为一种替代，可以使用这种技术。
Abstract
如白色念珠菌 ， 荚膜组织胞浆菌 ， 隐球菌致病酵母细胞发病机制的研究通常采用感染的哺乳动物宿主或宿主细胞（ 如巨噬细胞），然后由酵母定量用集落形成单元分析或流式细胞仪。虽然菌落形成单位枚举在该领域一直是最常用的方法，这种技术的缺点和局限性，包括在固体培养基上，低和/或可变电镀效率，这是比增长时，特别关注一些真菌物种增长缓慢野生型和突变株。流式细胞仪可以提供快速定量有关酵母活力，然而，采用流式细胞仪检测致病性酵母菌已为一些现实的原因，包括其成本高和生物安全方面的考虑限制。在这里，我们展示了一个基于图像使用流式细胞仪的方法Cellometer视觉（Nexcelom生物科技有限责任公司）与巨噬细胞共培养的量化可行的致病性酵母菌。我们的研究集中在两个人的真菌病原体检测： 组织胞浆菌和白色念珠菌。H.荚膜殖民肺泡巨噬细胞通过复制内巨噬细胞的吞噬体，在这里，我们定量评估H.增长荚膜酵母在RAW 264.7巨噬细胞用吖啶橙/碘化丙啶染色结合图像分析。我们的方法忠实地概括增长趋势作为衡量传统的菌落形成单位枚举，但显着增加灵敏度。此外，我们直接评估感染活的巨噬细胞与GFP表达菌株C.白色念珠菌 。我们的方法提供了一种快速，准确和经济的手段，重要关联机智的人类病原真菌的检测和定量h主机细胞。
Introduction
超过一个时间过程或不同的感染条件下，在与主机和/或宿主细胞的致病性真菌的研究经常需要量化的活的真菌细胞。枚举的菌落形成单位（CFU）是活的真菌细胞的数目已被测量的标准方法，通过它，但是，这种技术具有一些缺点和限制。首先，许多真菌物种生长缓慢。可见固体培养基上菌落增长需要1-2周，研究的步伐显着放缓。二，操纵在CFU电镀过程中的样品是一个费力的过程中，由于必须镀几个稀释度，以确保可数的菌落数。第三，CFU的数目通常低于镀活的微生物的数量，因为电镀效率低于100％。例如，二相性真菌病原体荚膜组织胞浆菌的电镀效率可高达90％，但常规低至30％，甚至更低（10％），为相关的真菌双晶片Paracoccidioides巴西 1，2。 白色念珠菌的电镀效率也受到变异3。最后，CFU分析占活和细胞分裂的活性，能够建立在固体培养基上的生长，而在许多情况下，这将是有用的，以确定是否存在和浓度的的死和/或代谢的非活动单元。
以前，一些致病性真菌物种的定量的流式细胞仪的方法已经描述4-6。然而，由于参与共享流式细胞仪用生物安全2级（BSL2）或BSL3级病原体生物安全遏制问题，采用这项技术已经有限。像流式细胞仪，图像仪是一个敏感和快速的细胞定量分析的方法。然而，可以进行图像分析，在一小部分的成本，而比较的结果7 -11。在这里，我们描述了进行图像分析致病真菌与宿主细胞的方法。我们证明了我们的方法使用两个人类病原真菌： 组织胞浆菌和白色念珠菌。H.荚膜是一种二态真菌病原体引起呼吸系统疾病，它生长在人类作为芽殖酵母和肺泡巨噬细胞内复制。 白色念珠菌是人类共生的物种，偶尔会导致念珠菌。我们表明，图像仪可快速定量的可视化能力，加上这些酵母菌。
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Protocol
1。感染的巨噬细胞与H.荚膜，白色念珠菌
- 在感染前16小时，在所需的密度在24孔板中的种子的巨噬细胞。在这个协议中，使用密度为3.0×10 5个细胞/孔。
- 添加对数期生长的真菌细胞中，在所需的感染复数（MOI）。这个协议可以容纳一系列的MOI（0.2 - 5.0）。对于感染的巨噬细胞与H.荚膜 ，我们使用了MOI为0.2。
- 1.5小时，让细胞吞噬后，洗巨噬细胞用PBS三次删除外真菌。
- 孵育前试样分析所需的小时数。受感染的巨噬细胞在低MOI 0.2在我们的实验中，继续生存了好几天，可分析的样品约每12-24小时。
2。巨噬细胞裂解
- 要解放巨噬细胞的真菌，去除媒体，用PBS洗3次，并添加0.5毫升无菌水。在这些条件下，巨噬细胞溶解和真菌细胞将保持不变。
- 在室温下孵育5分钟。
- 转移裂解无菌试管中，保持在冰上。
- 20微升裂解液转移到一个单独的管中，再加入20μLAO / PI解决方案。直接进入第5步：“图像流式细胞仪分析样品制备”
3。电镀CFU
- 裂解进行稀释10倍（从2.3步）媒体。
- 铠甲100微升每个稀释度，一式两份，HMM-琼脂糖板。 7-8天，在湿盒中，于37℃5％CO 2孵育板。
- 手动菌落计数平板上显示最低为100，最高1,000个不同的殖民地。
4。在现场巨噬细胞内真菌的可视化
- 为了收集活的巨噬细胞，洗涤细胞用PBS 3次。加入0.5毫升PBS孵育30分钟，在4°C。
- 要除去巨噬细胞组织培养井，轻轻吸管向上和向下几次。液体转移到无菌试管中，保持在冰上。
- 20微升样品转移到一个单独的试管中，然后加入20μLAO / PI解决方案。直接进入第5步：“图像流式细胞仪分析样品制备”。
5。图像流式细胞仪分析样品制备
- 彻底移液器的目标样本，然后转移到一次性细胞计数室20微升样品。
- 允许细胞定居室，持续30秒。
- 插入到图像流式细胞仪计数室。
6。 Cellometer仪器设置
- 荧光光学模块：VB-535-402和VB-660-502插入到系统中，并确保他们锁定到位。
- VB-535-402（在475 nm处激发，在535nm处的发射）的是，用于吖啶橙和GFP检测。
- VB-660-502（excitati在540 nm处，在660nm处的发射）用碘化丙啶检测。
- 打开图像流式细胞仪上，并打开附带的软件。
7。 Cellometer软件设置
- 选择预设“检测类型”和“细胞类型”，在下拉菜单含量。
- 活力，优化检测吖啶橙和碘化丙啶检测。
- 对于白色念珠菌感染的检测，检测GFP的检测进行了优化。
- 在顶部选择“选项”，然后单击“采取背景图片”，并允许操作完成。
- 点击“预览明场图像”。
8。图像采集程序
- 将图像流式细胞仪的样品室。
- 使用对焦旋钮，调整的重点。
- 一旦聚焦，点击“计数”，并允许图像采集操作完成。
- 圣雷莫VE一次性计数室，并适当处置。
9。图像数据分析
- 浓度和活力测量
- 一旦完成计数，靶细胞的浓度和生存能力在将显示在结果页面。
- 点击“导出”数据导出到FCS Express 4的白色念珠菌感染实验中的GFP的细胞群体分析。
- 白色念珠菌感染的细胞FCS快速分析
- 导入“。NXDAT”文件复制到FCS Express 4的积荧光直方图的结果。
- 将细胞种群门的直方图来确定白色念珠菌感染的细胞的人口百分比。
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Representative Results
我们使用Cellometer视觉图像流式细胞仪监测H.增长在巨噬细胞中的荚膜 。 RAW 264.7细胞感染H.荚膜酵母细胞和在不同时间点的样品进行AO / PI染色，随后通过基于图像的流式细胞仪分析。平行样品进行了分析由传统的CFU枚举。在每个时间点，在水中孵育样品裂解巨噬细胞，Cellometer的Vision软件（ 图1a和1b）由解放酵母细胞进行鉴定。我们观察到高度比较可行的酵母浓度的趋势，所检测到的基于图像的流式细胞仪分析和CFU枚举在各时间点（ 图1c）。正如预期的那样，绝对数量AO / PI染色检测活酵母菌的数量始终高于酵母菌能够在固体培养基上的菌落形成CFU分析评估，突出标志可行但非耕种细胞的的ificant号码。
活巨噬细胞内的真菌细胞的可视化可以通过用表达GFP的酵母菌株。骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）感染与C白假丝酵母菌的酵母细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）的控制下的ADH1启动子12（ 图2a）。感染BMDM GFP-C。白色念珠菌酵母多重感染（MOI）从0.1-10 GFP强度相当于增加感染的巨噬细胞内（ 图2a），以及感染的巨噬细胞的总百分比（ 图2b）。
图1。基于图像的流式细胞仪分析比较CFU枚举H. （一）RAW 264.7巨噬细胞感染H.荚膜在RAW 264.7巨噬细胞在体外感染。 荚膜酵母菌MOI为0.2。在感染后的24小时的间隔，巨噬细胞裂解及评估可行的酵母菌在与CFU列举平行AO / PI染色（二）代表明场（BR）和FL1/FL2（绿色/红色）组合图像AO / PI染色ħ 。荚膜裂解RAW 264.7巨噬细胞释放。只计算AO和PI阳性酵母菌中的荧光图像分割算法，而大PI染色RAW 264.7巨噬细胞（红色）被排除。 10X的放大倍率下拍摄图像（c）直接比较酵母增殖评估AO / PI染色和CFU枚举。的增长趋势的线性回归分析所测得CFU和Cellometer分析产率，R 2 = 0.9927。/ files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2。用表达GFP的菌株C. BMDM感染的量化白色念珠菌 （一）被俘虏的明场（BR）（顶部）和荧光图像（中）GFP-C。白色念珠菌感染BMDMs增加MOI。荧光强度的直方图显示GFP荧光的强度增加，作为教学语言的增加，即增加的数量C.白色念珠菌的 BMDM细胞（底部）。识别出的软件感染BMDMs的（二）感染的百分比是根据所显示的未感染的对照人群（MOI = 0）在基准荧光强度的线性标记中的应用。n作为教学语言，这表明增加感染BMDMs作为教学语言的增加。功能点击此处查看大图 。
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Discussion
图像流式细胞仪允许用户捕捉到高质量的图像，并使用专门的软件，进行快速定量细胞。一个潜在的挑战，通过图像分析微生物的发病机制中的字段是一个混合的人口中存在的细胞，包括哺乳动物宿主细胞，微生物计数。在这里，我们表明，图像分析，可用于体外巨噬细胞的感染过程中的量化可行的致病性酵母菌。我们的方法不仅忠实地概括在体外巨噬细胞感染实验期间观察到的真菌生长和活力的趋势，但也显示传统的菌落形成单位测定13相比，提高了灵敏度。
图像分析提供了一些实用的优点相比，要么的CFU列举或流式细胞仪进行定量的酵母细胞。电镀的CFUs时，实验室工作人员必须板块几个dilut离子，以确保可数个细胞每盘上，这可以是非常劳动密集的。图像分析消除了需要多个稀释。之前，我们已经表明，在固体培养基上的菌落形成往往是可变的，并在非常低的浓度，真菌可能无法形成菌落，而图像流式细胞仪使细胞计数，无论浓度13。检测和计数以非常低浓度的真菌的能力可以是非常有用的，在低剂量感染的早期阶段，或在间隙期间，当数字和生存能力可能是上面的边缘检测。此外，所产生的图像流式细胞仪的数据立即可用，而菌落可能需要几天的时间变得可见。虽然许多真菌物种可以用流式细胞仪检测，共享设施中的交叉污染的可能性，是一个问题。在这项研究中所使用的计数室提供了一个显着的优势，在生物安全方面，因为它是一次性注射器乐自足。此外，图像分析提供实用的优点时，较低的价格和更小的体积比传统的流式细胞仪，它可以是重要的较小的研究实验室11。
CFU枚举不能在除了它的实用的优点，提供的信息图像的酵母细胞的流式细胞仪。首先，只能够检测到，能够建立所选择的介质，这可能不能准确地代表可行的真菌的感染实验中存在实时数上菌落生长的真菌CFU枚举。此外，建立在固体培养基上菌落生长的能力可以有所不同，比较野生型和突变体菌株的真菌，它可以是一个实验偏置源14时，通过比较图像分析和CFU量化这些隐藏的偏差可以被曝光野生型和突变株。一旦一个特定的应变行为的特点是波个CFU枚举和图像分析，我们认为，图像分析，可以作为一种替代手段真菌量化。
在一般的图像流式细胞仪的一个限制是，它并没有允许收集尽可能多的数据点作为流式细胞仪。由于流式细胞仪的图像导出的量化数据从捕获的图像的数目有限的，这是很难的系统，以收集数百数千每个样品的细胞数以百万计的数据。然而，这种限制可能会由多个样品进行分组，一组对数据进行分析，以达到类似的数据点作为流式细胞仪。我们还想强调的是，这里使用的AO / PI染色法表示测量细胞活力的一种方式，并不一定表明细胞的活力和/或在任何给定的样本，建立在固体培养基上生长的能力。因此，虽然我们的方法提供了一种简便的方法，死/活酵母菌量化，也将是有趣的研究使用图像分析，结合细胞代谢指标，如FUN-1 15。
图像分析软件识别和计数细胞的大小和形状的基础上，因此，它绝对是至关重要的，这些参数被设置在每个实验仔细。用一个新的酵母菌株中，进行图像分析时，我们建议，一个第一数据进行比较，产生一个纯的酵母培养物计数酵母附加宿主细胞的混合物中生成的数据，以确保设置参数，例如，该软件可以区分两种类型的细胞。
今后，这项工作将是微生物检测和量化方法的进一步发展，通过图像分析的基础。例如，开发图像流式细胞仪的方法检测真菌内器官匀浆将是伟大的在野外使用。另一种未来的挑战将是到d制订并细化流式细胞仪的图像的方法和软件，例如，它可以用于量化的细菌细胞。在光学系统中，数码相机，和各种各样的荧光染料中的一个字段，可以实现在图像流式细胞仪图像的能力，分析细菌种群的，它可以提供一个更快速的方法，浓度和活力或活力测量与提高在比较的CFU或光密度的方法。总之，这里介绍的工作就是一个证明的概念，显示图像流式细胞仪是一个敏感的致病性酵母菌量化方法。基于图像流式细胞仪分析软件的复杂性提供了机会，在一个高度量化的方式分析宿主细胞之间的相互作用和致病真菌。此技术可适于处理真菌的发病机制在该领域的研究问题的范围内。
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Disclosures
作者利奥陈俪颖和本杰明·帕拉迪斯的Nexcelom生物科技有限责任公司的员工。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
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