그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성
Summary
그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.
Abstract
지질 다당류 (LPS)는 외막 이중층의 외부 전단지에 증착 그람 음성 박테리아의 주요 세포 표면 분자이다. LPS는 세 개의 도메인으로 분할 될 수있다 : 원심 O-다당류, 코어 올리고당 및 지질 지질로 이루어진 도메인 분자 종 및 3 – 데 옥시-D-Manno의-옥트 -2 – ulosonic 잔기 (KDO). 지질 도메인은 세균 세포의 생존에 필수적인 유일한 구성 요소입니다. 그 합성에 이어 지질 화학적 항생제 화합물에 대한 내성을 증진하기 위해, 그리고 호스트 선천성 면역 반응의 매개체하여 인식을 회피하기 위해, 그러한의 pH 나 온도 등의 환경 스트레스에 대응하여 수정된다. 다음 프로토콜은 그람 음성 세균으로부터의 지질의 소규모 및 대규모 분리 세부. 절연 물질은 화학적 후 박층 크로마토 그래피 (TLC) 또는 질량 분광법 (MS)에 의해 특징된다. 또한에 F의 레이저 탈착 / 이온화 타임 매트릭스 지원빛 (MALDI-TOF) MS는, 우리는 또한 충돌 유발 분해 (CID)에 연결된 전자 분무 이온화 (ESI) 및 새로 채용 자외선 광분해 (UVPD) 방법을 사용하여 지질에게 분자 종을 분석 탠덤 MS의 프로토콜을 설명합니다. 우리의 MS 프로토콜은 고유 또는 새로운 화학 수정을 포함하는 지질 분자의 특성에 가장 중요한, 화학 구조의 명백한 결정을 위해 수 있습니다. 우리는 또한 TLC로 분석 박테리아 세포에서 지질의 방사성 동위 원소 표지, 이후 격리를 설명합니다. MS-기반 프로토콜에 상대적 TLC는보다 경제적이고 신속한 특성화 방법을 제공하지만, 명백하게 알려진 화학 구조의 표준을 사용하지 않고 화학 구조 지질을 할당 할 수 없다. 지난 20 년간 지질의 분리 및 특성은 그람 음성 세균, 항생제 RESIS의 메커니즘의 생리에 대한 우리의 이해를 향상하는 많은 흥미로운 발견되었다tance, 인간의 타고난 면역 반응 및 항균 화합물의 개발에 많은 새로운 목표를 제공하고 있습니다.
Introduction
지질 다당류 (LPS)는 거의 모든 그람 음성균의 주요 외부 표면 분자이며 세 분자 도메인으로 구성 원위 O-항원 다당류, 코어 올리고당, 및 막 – 관련 지질의 외측 전단지에 증착 도메인 외막 이중층 1,2. 지질 도메인은 지질이 약한 산 가수 분해 1시 LPS의 클로로포름 가용 부분으로 정의 할 수 있습니다 3 – 데 옥시-D-Manno의 10 월 2 ulosonic (KDO) 잔류 물과 지질 분자 종으로 구성 2. 모델 생물 대장균 (E. 콜라이) 1,2 관찰 주요 지질 종과 일치; 표준 지질 분자는 화학적 헥사 아 실화 및 비스 – 인산화 diglucosamine 백본으로 정의 될 수있다. 그람 음성 박테리아에 걸쳐 보존 나인 구조적으로 표현 된 유전자는 지질의 생산 도메인 (그림 1) 1, 2에 대한 책임이 있습니다. 대부분의 박테리아는 지질 3의 추가 화학적 변형에 참여 계통 보호의 정도에 차이가 유전자의 추가 집합을 보유하고 있습니다. 탈 인산화, 아실 사슬의 제거와 같은 아미노 당 (예 aminoarabinose) 및 / 또는 phosphoethanolamine 화학적 잔기의 첨가는 일반적으로 관찰 활동 (도 1)이다. 지질 변형에 대해 책임 효소의 많은 직접적 가의 양이온 등의 환경 신호에 의해 활성화되고, 또는 그 발현이 성분 응답 레귤레이터 시스템 (3)에 의해 규제된다.
호스트 타고난 면역 시스템에 의해 지질 종의 인식은 수신자 같은 수용체 4/myeloid 분화 인자 2 (TLR4/MD2) 공동 수용체 (4)에 의해 매개된다. MD2와 지질 아실 체인뿐만 아니라 TLR4 및 지질의 1 및 4 '인산기 립의 강한 연관을 촉진 간의 소수성 세력TLR4/MD2 4,5와 아이디. 실화 상태 또는 지질의 음전하 영향 TLR4/MD2 기반 지질을 변경 수정은 인식과 타고난 면역 반응의 하류 자극은 NF-κB와 같은 TNFα와 IL1-β 6,7와 같은 염증 매개 활성제. 지질의 음전하 마스크 수정은 세포 표면 3,8를 음성에게 그램 바인딩에서 살균 양이온 항균 펩타이드를 방지합니다. 많은 지질의 수정은 이러한 인간의 호스트 내부 또는 생태 학적 틈새 시장과 같은 특정 환경 조건에서 세균의 체력을 증가하는 가정합니다. 이러한 이유로 많은 수정 효소는 항균 화합물의 합리적인 개발에 매력적인 대상입니다. 지질 구조체의 화학적 다양성, 유기체 및 / 또는 환경, 이러한 다양한 구조의 생물학적 영향에 대하여 지질의 구조적 특성화 t에서 중요한 노력을하게그는 그람 음성 박테리아의 연구.
전체 박테리아 지질 분자의 분리는 최종 정제 절차 9-11이어서 세균 세포 표면으로부터 LPS의 추출, 지질을 해방하는 가수 분해 단계를 포함한다. 가장 자주 인용 LPS 추출 절차는 첫 번째 웨스트 팔과 쟌 (10)에 의해 도입, 핫 페놀 물 추출 절차입니다. 추출 전체 LPS는 화학적으로 지질의 말단 글루코사민 설탕 (그림 1)의 6'-히드 록에서 KDO을 분리 약한 산 가수 분해를 받게되면. 수많은 함정 높은 위험 시약의 사용 등 핫 페놀 물 절차 존재 공동 추출한 핵산 및 단백질, 며칠을 분해 할 필요가 프로토콜 (10)을 완성해야한다.
첫 번째 Caroff 및 Raetz (12, 13)에 의해 개발 된 우리의 실험실은 또한 지질의 추출 및 분리를 개발했습니다. 핫 페놀 물 절차에 비해, 여기에서 제시된 방법은보다 신속하고 효율적이며 5 ㎖에서 체류 리터 배양 부피의 넓은 범위를 수용한다. 또한, 핫 페놀 물 추출과는 달리, 우리의 방법은 지질 종의 최적의 복구를 제공, LPS의 거친 또는 부드러운 유형을 선택하지 않습니다. 우리의 프로토콜에서, 전체 박테리아 세포의 화학적 용해는 LPS는 원심 분리에 의해 펠릿 화 될 수 클로로포름, 메탄올 및 물을 혼합하여 수행된다. 약한 산 가수 분해 및 용매 추출 (Bligh 고 – 다이어)의 조합은 공유 연결된 다당류에서 지질을 해방하는 데 사용됩니다. Bligh 고 및 다이어의 방법은 제 14의 조직은, 동물 및 식물의 다양한 지질 종의 추출에 적용이 최종 분리 단계 지질 A.에서 가수 분해 된 폴리 사카 라이드를 분리하는 여기 변성시키고, 클로로포름에 용해 지질 선택적 하부 유기적으로 분할 상. 또한, 지질를 정화하는 역상 또는음이온 교환 칼럼 크로마토 그래피 (12)를 사용할 수있다.
전체 세포에서 지질 종의 분리 후, 분석 방법의 수는 NMR, TLC 및 MS-기반 분석과 같은 절연 물질의 화학 구조를 특성화하기 위해 사용될 수있다. NMR은 비파괴 구조 규명이 가능하고, 글리코 시드 결합, 아실 체인 위치의 명백한 할당, aminoarabinose 또는 phosphoethanolamine 15-17와 같은 지질 수정에 대한 첨부 파일 사이트의 할당과 관련된 구조적인 세부 사항을 제공합니다. 지질의 NMR 분석은 우리의 프로토콜 내에서 설명되지 않지만, 그 밖에 15,16 충분히 설명되었다. 신속한 분석을 위해 TLC 방법이 자주 사용하는 기반으로하지만, 정밀 화학 구조에 대한 직접적인 정보를 제공하기 위해 실패합니다. MS 기반 프로토콜은 지질 구조 (18, 19)의 특징을 가장 자주 사용되는 방법이다. 매트릭스 연관된 레이저 탈착 이온화 (MALDI)-MS는 종종 처음 그대로 지질 종을 조사하는 데 사용됩니다. 단독으로 하전 된 이온을 분석 우리의 추출 절차에 따라 제조에서 생성됩니다. 더 미세 구조 분석이 요구되기 때문에, MS / MS 기반의 방법은 MALDI-MS보다 더 많은 정보를 증명한다. 구조적으로 정보를 제품의 이온 18,20,21를 생성하기 위해, (ESI) 전구체 이온이 충돌 유발 분해 (CID) 또는 자외선 광분해 (UVPD)에 의해 더 조각난 단일 또는 다중 충전 지질 이온화 전기 분무에 결합. 전구체 이온으로부터 중성 지질 감소 제품도 종종 구조 정보의 부가 층을 제공하는 ESI-MS 동안 생성된다.
탠덤 질량 분석 (MS / MS)의 지질 구조의 해명을위한 필수 불가결하고 다양한 방법으로 입증되었습니다. MS / MS 동안, 이온은 이온 전구체의 구조를 설명하기 위하여 사용될 수있는 진단 조각화 패턴을 수득하기 위해 활성화된다. 가장 널리 AVAilable MS / MS 방법은 CID입니다. 이 방법은 해리 리드 에너지 증착의 결과로, 불활성 가스를 타겟으로 선택된 전구체 이온의 충돌을 통해 단편 이온을 생성한다. CID는 세균 종 22-33 광범위한 지질 구조체의 할당에서 중요한 도구를 입증했다.
CID가 가장 보편적으로 구현 MS / MS 방법이지만, 그것은 제품 이온의 한정된 어레이를 생성한다. 193 nm의 UVPD 대안 및 보완 MS / MS 방법입니다. 이 방법은 이온을 조사하는 레이저를 사용하고, 광자의 흡수 이온 및 후속 해리 통전 초래한다. 이 높은 에너지 MS / MS 기술은 CID보다 제품 이온의보다 다양한 배열을 생산하고, 따라서 더 많은 정보를 조각 패턴을 제공합니다. 특히, UVPD는 글리코 시드, 아민, 아와 CC 연계 채권 18,21,34에서 분열에 따라 지질 종의 미묘한 변화에 대한 정보를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 박테리아의 전체 세포에서 지질 종의 분리를 자세히 설명하고, 화학적으로이 절연 재료의 특성을 TLC 또는 MS 기반의 분석 방법을 설명했다. 텐덤 질량 분석법은 생물학적 화합물의 드 노보 구조적 특성에 대한 강력한 전략이며, 자연에서 볼 수있는 지질 분자의 갑옷의 한 벌의 화학적 특성 분석을위한 매우 중요한 이점입니다. CID 및 UVPD 지질 분자에 대한 키 지문을 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 또한 JSB에 R01GM103655을 부여 웰치 재단의 F1155 및 NIH에 의해 지원되었다 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금 AI064184 및 AI76322에 의해 MST 연구에 육군 연구 사무실에서 그랜트 61789-MA-MUR에 의해 지원되었다
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
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