Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën
Summary
Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.
Abstract
Lipopolysaccharide (LPS) is het belangrijkste celoppervlak molecuul van gram-negatieve bacteriën, afgezet op de buitenste laag van de buitenste membraan dubbellaag. LPS kan worden onderverdeeld in drie gebieden: de distale O-polysaccharide, een kern oligosaccharide en de lipide A-domein bestaat uit een lipide A moleculaire species en 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic zuurresten (Kdo). De lipide A-domein is het enige essentiële component voor bacteriële celoverleving. Na de synthese wordt lipide A chemisch gewijzigd ingevolge omgevingsstress zoals pH of temperatuur, de weerstand tegen antibiotische verbindingen bevorderen en herkenning omzeilen door mediatoren van de gastheer aangeboren immuunrespons. Het volgende protocol beschrijft de klein-en grootschalige isolatie van lipide A uit gram-negatieve bacteriën. Geïsoleerde materiaal wordt vervolgens chemisch gekenmerkt door dunnelaagchromatografie (TLC) of massa-spectrometrie (MS). Naast de matrix-assisted laser desorptie / ionisatie-tijd van flicht (MALDI-TOF) MS, beschrijven wij ook onze tandem MS protocollen voor het analyseren van lipide A moleculaire deeltjes met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) gekoppeld aan botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) en de nieuw aangeworven ultraviolet fotodissociatie (UVPD) methoden. Onze MS protocollen zorgen voor eenduidige bepaling van de chemische structuur, van cruciaal belang voor de karakterisering van lipide A moleculen die unieke of nieuwe chemische modificaties bevatten. Wij de radioisotopische etikettering, en de daaropvolgende isolatie van lipide A beschrijven ook uit bacteriële cellen voor analyse door TLC. Ten opzichte van MS-gebaseerde protocollen, TLC biedt een meer economisch en snelle karakteriseringsmethode, maar kan niet worden gebruikt om lipide A chemische structuren ondubbelzinnig overdragen zonder het gebruik van standaarden van bekende chemische structuur. In de afgelopen twee decennia isolatie en karakterisatie van lipide A heeft geleid tot talrijke interessante ontdekkingen die ons begrip van de fysiologie van gram-negatieve bacteriën, mechanismen van antibiotische weerstand verbeterdafstand, de menselijke aangeboren immuunrespons en hebben vele nieuwe doelen die in de ontwikkeling van antibacteriële verbindingen.
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS) is het belangrijkste buitenoppervlak molecuul bijna alle Gram-negatieve organismen en bestaat uit drie moleculaire domeinen: een distaal O-antigeen polysacharide, een kern oligosaccharide en de membraan-geassocieerde lipide A domein afgezet op de buitenste laag van de buitenste membraan dubbellaag 1,2. De lipide A-domein bestaat uit 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) residuen en een lipide A moleculaire species, waarbij lipide A kan worden gedefinieerd als de chloroform oplosbare gedeelte van LPS bij milde zure hydrolyse 1, 2. De standaard lipide A molecuul kan chemisch worden gedefinieerd als een diglucosamine backbone die hexa-geacyleerd en bis-gefosforyleerd, in overeenstemming met de grote lipide A species waargenomen in het modelorganisme Escherichia coli (E. coli) 1,2. Negen constitutief tot expressie gebrachte genen, geconserveerd Gram-negatieve bacteriën zijn verantwoordelijk voor de productie van de lipide A-domein (Figuur 1) 1,2. De meeste bacteriën hebben een extra set van genen, die variëren in de mate van fylogenetische conservering, die deelnemen aan verdere chemische modificatie van lipide A 3. Defosforylering, verwijdering van acylketens, en de toevoeging van chemische groepen zoals amino suikers (bijv. aminoarabinose) en / of fosfo zijn de meest waargenomen activiteiten (figuur 1). Veel van de enzymen verantwoordelijk voor lipide A modificatie rechtstreeks geactiveerd door signalen uit de omgeving, zoals tweewaardige kationen, of de expressie wordt gereguleerd door twee componenten respons-ademautomaatsystemen 3.
Erkenning van lipide Een soort door de gastheer aangeboren immuunsysteem wordt gemedieerd door de Toll-like receptor 4/myeloid differentiatie factor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe krachten tussen MD2 en de lipide A acylketens, en tussen TLR4 en de 1 en 4 'fosfaatgroepen van lipide A bevorderen de sterke associatie van lipid A met TLR4/MD2 4,5. Modificaties die acylering staat of de negatieve lading van lipide A invloed TLR4/MD2 gebaseerd lipide veranderen Een erkenning en stroomafwaarts stimulatie van de aangeboren immuunrespons activatoren NF-kB en ontstekingsmediatoren zoals TNF en IL1-β 6,7. Wijzigingen die de negatieve lading van lipide A maskeren voorkomen ook bacteriedodende kationische antimicrobiële peptiden binden aan celoppervlak-negatieve Gram 3,8. Veel lipide A modificaties worden verondersteld om bacteriële film onder specifieke milieuomstandigheden, zoals in de menselijke gastheer of in een ecologische niche verhogen. Om deze reden veel modificatie enzymen zijn een aantrekkelijk doelwit in de rationele ontwikkeling van antimicrobiële verbindingen. De diversiteit van chemische structuren lipide A met betrekking tot organisme en / of omgeving en de biologische gevolgen van deze verschillende structuren structurele karakterisatie van lipide A een belangrijke inspanning in thij studie van gram-negatieve bacteriën.
Isolatie van lipide A moleculen uit hele bacteriën omvat de extractie van LPS uit het bacteriële celoppervlak, een hydrolytische stap lipide A bevrijden, gevolgd door een laatste zuiveringsprocedure 9-11. De meest genoemde LPS extractie procedure is de hete-fenol water extractie procedure, voor het eerst geïntroduceerd door Westphal en Jann 10. Na extractie geheel LPS onderworpen aan milde zure hydrolyse, die chemisch scheidt Kdo van de 6'-hydroxylgroep van het distale glucosamine suiker van lipide A (Figuur 1). Talrijke valkuilen bestaan voor de warm-fenol water procedure, inclusief het gebruik van een groot gevaar reagens, de noodzaak van co-geëxtraheerde nucleïnezuren en eiwitten, en verscheidene dagen afgebroken moeten het protocol 10 voltooien.
Ons laboratorium heeft verder ontwikkeld de extractie en isolatie van lipide A als eerste ontwikkeld door Caroff en Raetz 12,13. In vergelijking met procedures warm-fenol water, de hier gepresenteerde methode is snel en efficiënt en biedt een breed scala aan cultuur volumes van 5 ml tot meerdere liters. Bovendien, in tegenstelling warm-fenol water extracties, onze methode niet kiezen voor ruwe of gladde types van LPS, het verstrekken van optimaal herstel van lipide A soorten. In het protocol wordt chemische lysis van hele bacteriecellen uitgevoerd met een mengsel van chloroform, methanol en water, waar LPS kan worden gepelleteerd door centrifugatie. Een combinatie van milde zure hydrolyse en oplosmiddel extracties (Bligh-Dyer) worden gebruikt om lipide A bevrijden van covalent gebonden polysaccharide. Werkwijze volgens Bligh en Dyer werd eerst toegepast op de winning van lipide soorten van verschillende dierlijke en plantaardige weefsels 14, hier aangepast om gehydrolyseerde polysaccharide scheiden van lipide A. In dit laatste scheidingsstap, chloroform oplosbare lipiden selectief verdelen in de onderste organische fase. Om verder te zuiveren lipide A, omgekeerde-fase ofanionische kolom-chromatografie kan worden gebruikt 12.
Na isolatie van lipide A soort uit gehele cellen, kan een aantal analytische methoden worden gebruikt om de chemische structuur van het geïsoleerde materiaal zoals NMR, TLC en MS-gebaseerde analyse karakteriseren. NMR zorgt voor niet-destructieve structuuropheldering en biedt constructieve details over glycosidebindingen, ondubbelzinnige toewijzing van acylketen posities en toewijzing van bevestigingsplaatsen voor lipide A aanpassingen zoals aminoarabinose en fosfoethanolamine 15-17. NMR-analyse van lipide A niet in ons protocol beschreven, maar is voldoende 15,16 elders beschreven. Voor een snelle analyse TLC-gebaseerde methoden worden vaak gebruikt, maar niet om directe informatie over fijne chemische structuur te bieden. MS gebaseerde protocollen zijn de meest gebruikte methode om lipide A structuren 18,19 karakteriseren. Matrix geassocieerd laser desorptie ionisatie (MALDI)-MS wordt vaak gebruikt om aanvankelijk overzicht intact lipide A soort. Enkelvoudig geladen ionen worden gegenereerd analyt bereid volgens onze extractieprocedures. Naarmate er meer fijne structurele analyse is nodig, MS / MS-gebaseerde methoden blijken informatiever dan MALDI-MS. Gekoppeld aan ionisatie electrospray (ESI) enkelvoudig of meervoudig geladen lipide A precursorionen verder versnipperd door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) of ultraviolet fotodissociatie (UVPD), structureel informatieve product ionen 18,20,21 genereren. Neutrale verlies producten van lipide A precursor ionen worden ook vaak ontstaan tijdens ESI-MS voorzien van een extra laag van structurele informatie.
Tandem massaspectrometrie (MS / MS) blijkt een onmisbaar en veelzijdige werkwijze voor de opheldering van lipide A structuren. Tijdens MS / MS worden ionen geactiveerd op een diagnostische fragmentatie patroon dat kan worden gebruikt om de structuur van het precursorion helderen opleveren. De meest available MS / MS methode is CID. Deze methode levert fragment ionen via botsingen van de geselecteerde precursorion met een inert doelgas, waardoor energie depositie die leidt tot dissociatie. CID heeft bewezen een kritiek hulpmiddel in de opdracht van lipide A structuur voor een groot aantal bacteriesoorten 22-33.
Hoewel CID is de meest algemeen ingevoerd MS / MS methode, genereert een beperkte reeks producten ionen. 193 nm UVPD is een alternatieve en complementaire MS / MS methode. Deze werkwijze gebruikt een laser om ionen bestralen en de absorptie van fotonen gevolg bekrachtiging van de ionen en daaropvolgende dissociatie. Deze hogere energie-MS / MS techniek levert een meer divers aanbod van product-ionen dan CID en zorgt zo voor meer informatieve fragmentatiepatronen. In het bijzonder, UVPD biedt informatie over subtiele veranderingen in lipide Een soort gebaseerd op breuklijnen in glycoside, amine, acyl-en CC-linked bonds 18,21,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we de isolatie van lipide Een soort van hele cellen van bacteriën gedetailleerde en beschreven TLC of MS gebaseerde analytische methoden om chemisch deze geïsoleerde materiaal karakteriseren. Tandem massaspectrometrie is een krachtige strategie voor de novo structurele karakterisatie van biologische verbindingen, en is van onschatbare waarde voor de chemische karakterisering van het arsenaal van lipide A moleculen waargenomen in de natuur. CID en UVPD zijn twee complementaire activering…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies AI064184 en AI76322 van de National Institutes of Health (NIH) en door Grant 61789-MA-MUR van het leger Bureau Onderzoek naar MST onderzoek werd ook gesteund door Welch Foundation Grant F1155 en NIH verlenen R01GM103655 naar JSB
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
- Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
- Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
- Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
- Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
- Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
- Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
- Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
- Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
- Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
- Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
- Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
- Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochimie. 45, 14427-14440 (2006).
- Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
- Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
- Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
- Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
- Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
- Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
- Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
- Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
- El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
- Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
- Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
- Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
- Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
- Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
- Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
- Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
- Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
- Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
- Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
- Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
- Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
- Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
- Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
- Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
- Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).
