Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien
Summary
Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.
Abstract
Lipopolysaccharid (LPS) ist die Hauptzelloberflächenmolekül von gram-negativen Bakterien auf dem äußeren Blatt der äußeren Membran-Doppelschicht abgeschieden. LPS kann in drei Bereiche unterteilt werden: der distale O-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid und das Lipid A-Domäne, die aus einer Lipid-A-Molekularspezies und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic Säurereste (Kdo). Die Lipid-A-Domäne ist die einzige Komponente, die für bakterielle Zellüberleben. Nach der Synthese wird Lipid A chemisch in Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie pH oder Temperatur verändert, die Förderung von Resistenz gegen Antibiotika-Verbindungen und die Erkennung durch Mediatoren der Wirts angeborenen Immunantwort zu entziehen. Das folgende Protokoll beschreibt die kleinen und großen Isolierung von Lipid A aus gram-negative Bakterien. Isoliert Material wird dann chemisch durch Dünnschicht-Chromatographie (DC) oder Massenspektrometrie (MS) gekennzeichnet. Zusätzlich zur Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations-Zeit fLicht (MALDI-TOF) MS beschreiben wir auch Tandem-MS-Protokolle für die Analyse von Lipid einer molekularen Spezies mit Elektrospray-Ionisation (ESI), um eine Kollision induzierte Dissoziation (CID) gekoppelt ist und neu eingestellten UV-Photodissoziation (UV-PD)-Methoden. Unsere MS-Protokolle ermöglichen die eindeutige Bestimmung der chemischen Struktur, ausschlaggebend für die Charakterisierung der Lipid-A-Moleküle, die einzigartig oder neuartige chemische Modifikationen enthalten. Wir beschreiben auch die Radioisotop-Markierung, und die anschließende Isolierung von Lipid A aus Bakterienzellen für die Analyse durch TLC. Bezogen auf MS-basierte Protokolle bietet TLC eine wirtschaftlichere und schnelle Charakterisierung Verfahren, kann aber nicht verwendet werden, um eindeutig zuordnen Lipid eine chemische Strukturen ohne die Verwendung von Standards bekannter chemischer Struktur sein. In den letzten zwei Jahrzehnten Isolierung und Charakterisierung von Lipid A auf zahlreiche spannende Entdeckungen geführt, die unser Verständnis der Physiologie von gram-negativen Bakterien, die Mechanismen der Antibiotika-Widerstand verbessert habentung, die menschliche angeborene Immunantwort, und viele neue Ziele in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen vorgesehen.
Introduction
Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Hauptfläche Molekül fast allen gramnegativen Organismen und besteht aus drei molekularen Domänen: eine distale O-Antigen-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid, und die Membran-assoziierten Lipid A-Domäne auf dem äußeren Blatt der abgeschiedene Außenmembrandoppelschicht 1,2. Die Lipid-A-Domäne besteht aus 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) Resten und einer Lipid-A-Molekülspezies, wobei Lipid A kann als das Chloroform lösliche Teil von LPS bei milder Säurehydrolyse 1 definiert ist, 2. Die Standard-Lipid-A-Molekül kann chemisch als diglucosamine Rückgrat, Hexa-acyliert und bisphosphoryliertes definiert werden, im Einklang mit den in den Modellorganismus Escherichia coli (E. coli) 1,2 beobachtet Haupt Lipid A-Spezies. Neun konstitutiv exprimierte Gene, während gram-negative Bakterien konserviert ist, sind für die Herstellung von Lipid-A-Domäne (Fig. 1) 1,2 verantwortlich. Die meisten Bakterien haben einen zusätzlichen Satz von Genen, die im Grad der phylogenetischen Konservierung variieren, die in weitere chemische Modifikation der Lipid-A-3 teilnehmen. Dephosphorylierung, Entfernen von Acylketten, und die Zugabe von chemischen Gruppierungen, wie Amino-Zucker (z. B. Aminoarabinose) und / oder Phosphoethanolamin sind die am häufigsten beobachteten Aktivitäten (1). Viele der Enzyme, die für Lipid A Modifikation verantwortlich sind, werden direkt durch Umweltsignale, wie zweiwertige Kationen aktiviert ist, oder deren Expression durch zwei Teilantwort-Regler-Systeme 3 geregelt.
Anerkennung von Lipid A-Arten durch den Host angeborene Immunsystem wird durch die Toll-like-Rezeptor-4/myeloid Differenzierungsfaktor 2 (TLR4/MD2) Co-Rezeptor 4 vermittelt. Hydrophobe Kräfte zwischen MD2 und der Lipid-A-Acyl-Ketten, sowie zwischen TLR4 und der 1 und 4 'Phosphatgruppen von Lipid A fördern die starke Assoziation der Lippeid A mit TLR4/MD2 4,5. Änderungen, die Acylierung Staat oder die negative Ladung der Lipid A Auswirkungen TLR4/MD2 basierend Lipid A verändern Anerkennung und nachgelagerten Stimulation der angeborenen Immunantwort Aktivatoren NF-kB und Entzündungsmediatoren wie TNF und IL1-β 6,7. Änderungen, die die negative Ladung der Lipid A-Maske verhindern auch bakterizide kationische antimikrobielle Peptide aus der Bindung an gram-negative Zelloberflächen 3,8. Viele Lipid A Änderungen Hypothese aufgestellt, um bakterielle Fitness unter bestimmten Umweltbedingungen, wie im menschlichen Wirt oder in einer ökologischen Nische zu erhöhen. Aus diesem Grund viele Modifikation Enzyme sind attraktive Ziele in der Rationalisierung der antimikrobielle Verbindungen. Die chemische Vielfalt der Lipid-A-Strukturen in Bezug auf Organismus und / oder Umwelt und der biologischen Auswirkungen dieser unterschiedlichen Strukturen machen die strukturelle Charakterisierung von Lipid A ein wichtiges Unterfangen in ter studieren gram-negativer Bakterien.
Isolierung von Lipid-A-Moleküle aus ganzen Bakterien umfasst die Extraktion von LPS aus der Bakterienzelloberfläche, einer hydrolytischen Schritt Lipid A zu befreien, gefolgt von einem abschließenden Reinigungsverfahren 9-11. Die am häufigsten genannten LPS Extraktionsverfahren ist das heiße Wasser-Phenol-Extraktionsverfahren, die zuerst von Westphal und Jann 10 eingeführt. Nach Extraktion ganzen LPS ist mild-sauren Hydrolyse, die chemisch trennt Kdo von der 6'-Hydroxylgruppe des distalen Glucosamin-Zucker-Lipid A (Fig. 1) unterzogen. Zahlreiche Gefahren für die Warmwasserphenolverfahren einschließlich der Verwendung eines Hochrisiko-Reagens vorhanden ist, werden die Notwendigkeit der Zusammenarbeit extrahierten Nukleinsäuren und Proteinen und einigen Tagen abgebaut erforderlich, um das Protokoll 10 zu vervollständigen.
Unser Labor hat sich weiter die Extraktion und Isolierung von Lipid A entwickelt, wie zuerst von Caroff und Raetz 12,13 entwickelt. Im Vergleich zu Heißwasserverfahren Phenol ist das hier vorgestellte Verfahren schneller und effizienter und bietet eine breite Palette von Kulturvolumen von 5 ml bis mehrere Liter. Darüber hinaus, im Gegensatz zu Warmwasser Phenol-Extraktionen, unsere Methode funktioniert nicht für grobe oder glatte Typen von LPS wählen, eine optimale Wiederherstellung der Lipid-A-Arten. In unserem Protokoll wird eine chemische Lyse ganzer Bakterienzellen unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser, wo LPS kann durch Zentrifugation pelletiert werden. Eine Kombination von milder Säurehydrolyse und Lösemittelextraktion (Bligh-Dyer) werden verwendet, um Lipid A aus kovalent gebundenen Polysaccharids zu befreien. Das Verfahren von Bligh und Dyer wurde die Extraktion von Lipid-Spezies aus einer Vielzahl von Tier-und Pflanzengeweben 14 aufgebracht, hier modifiziert, um hydrolysierte Polysaccharid aus Lipid A. In diesem letzten Trennstufe zu trennen, Chloroform löslichen Lipide selektiv in die untere organische partitionieren Phase. Um weiter zu reinigen Lipid A, Umkehrphasen-oderAnionenaustausch-Säulenchromatographie verwendet werden 12.
Nach der Isolierung von Lipid A-Spezies aus ganzen Zellen, kann eine Anzahl von analytischen Verfahren verwendet, um die chemische Struktur des isolierten Material, wie NMR, TLC und MS-basierte Analyse charakterisiert werden. NMR ermöglicht die zerstörungsfreie Strukturaufklärung und stellt strukturelle Details zu Glycosidbindungen, eindeutige Zuordnung von Acyl-Kettenpositionen und Zuordnung der Bindungsstellen für Lipid-A-Modifikationen wie Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin 15-17 zusammen. NMR-Analyse des Lipid A ist nicht in unserem Protokoll diskutiert, hat aber ausreichend anderswo 15,16 beschrieben. Für die schnelle Analyse TLC basierte Methoden werden häufig verwendet, aber nicht, um direkte Informationen über die feinen chemischen Struktur zu schaffen. MS-basierte Protokolle sind die am häufigsten verwendete Methode zur Charakterisierung von Lipid-A-Strukturen 18,19. Matrix zugeordnet Laserdesorptions-Ionisation (MALDI)-MS wird oft verwendet, um zunächst intakt überblicken Lipid A-Spezies. Einfach geladene Ionen von Analyten gemäß unserer Extraktionsverfahren hergestellt erzeugt. Da immer mehr Feinstrukturanalyse erforderlich ist, MS / MS-basierte Methoden beweisen, informativer als MALDI-MS. Gekoppelt Elektrospray Ionisation (ESI) einzeln oder mehrfach geladenen Lipid-A-Vorläufer-Ionen sind weitere Fragmentierung durch Kollision induzierte Dissoziation (CID) oder UV-Photodissoziation (UV-PD), strukturell informative Produkt-Ionen 18,20,21 generieren. Neutralverlust Produkte von Lipid A-Vorläufer-Ionen werden häufig während ESI-MS erzeugt eine zusätzliche Schicht von Strukturinformationen.
Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) hat sich als notwendig und vielseitiges Verfahren zur Aufklärung der Lipid-A-Strukturen sein. Während MS / MS werden Ionen aktiviert wird, um eine Diagnosefragmentierungsmuster, die verwendet werden können, um die Struktur des Vorläuferionen aufzuklären ergeben. Die am weitesten AVAilable MS / MS-Methode ist CID. Dieses Verfahren erzeugt Fragment-Ionen durch Stöße der ausgewählten Vorläuferionen mit einem inerten Zielgas, was zu Energiedeposition, die zur Dissoziation führt. CID hat ein wichtiges Werkzeug bei der Zuordnung der Lipid A-Struktur für eine Vielzahl von Bakterienarten 22-33 bewährt.
Obwohl CID ist die universell einsetzbar MS / MS-Verfahren, erzeugt es eine begrenzte Reihe von Produkt-Ionen. 193 nm UV-PD ist eine alternative und komplementäre MS / MS-Methode. Dieses Verfahren verwendet einen Laser, um Ionen zu bestrahlen, und die Absorption von Photonen führt Erregung der Ionen und anschließende Dissoziation. Diese höhere Energie MS / MS-Technik erzeugt eine Vielfalt von Produkt-Ionen als CID und bietet mehr informative Fragmentierungsmuster so. Insbesondere UV-PD bietet Informationen zu subtilen Veränderungen in der Lipid-A-Arten, basierend auf Spaltungen an glykosidischen, Amin-, Acyl-und CC-Bindungen verknüpft 18,21,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von Lipid-A-Arten aus ganzen Zellen von Bakterien beschrieben und beschrieben TLC oder MS auf Basis analytischer Methoden, um dieses isolierte Material chemisch zu charakterisieren. Tandem-Massenspektrometrie ist eine wirkungsvolle Strategie für die de novo Strukturaufklärung von biologischen Verbindungen und ist von unschätzbarem Wert für die chemische Charakterisierung der Palette der Lipid in der Natur beobachtet A-Moleküle. CID und UV-PD sind zwei sich ergä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AI064184 und AI76322 von den National Institutes of Health (NIH) und von Grant 61789-MA-MUR vom Army Research Office, um MST Forschung wurde auch von Welch Foundation Grants F1155 und NIH gewähren R01GM103655 zu GKI unterstützt
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
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