Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Summary

Isolering og karakterisering av lipid Et domene av lipopolysakkarid (LPS) fra gramnegative bakterier gir innsikt i celleoverflatebaserte mekanismer for antibiotikaresistens, bakteriell overlevelse og fitness, og hvordan kjemisk mangfoldig lipid A molekylære arter differentially modulere vert medfødte immunresponser.

Abstract

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig celleoverflate-molekyl av gram-negative bakterier, avsettes på den ytre paknings av den ytre membran-dobbeltlag. LPS kan deles inn i tre domener: den distale O-polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og lipid A domene som består av en lipid A-molekylære arter og 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic ester (KDO). De lipid A-domenet er den eneste komponent avgjørende for bakteriecelleoverlevelse. Etter at syntesen er lipid A kjemisk modifisert som reaksjon på ytre påvirkninger som for eksempel pH-verdi eller temperatur, for å fremme resistens mot antibiotika forbindelser, og for å unngå gjenkjennelse av mediatorer av verten medfødte immunrespons. Den følgende protokoll beskriver liten og stor skala isolering av lipid A fra gram-negative bakterier. Isolert materiale blir deretter kjemisk karakterisert ved tynnsjiktskromatografi (TLC) eller masse-spektrometri (MS). I tillegg til matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering-tid på flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS protokoller for å analysere lipid A molekylære arter ved hjelp av electro ionisering (ESI) koplet til kollisjon indusert dissosiasjon (CID) og nytilsatte ultrafiolett photodissociation (UVPD) metoder. Våre MS protokoller tillate utvetydig bestemmelse av kjemisk struktur, viktig å karakterisering av lipid A molekyler som inneholder unike eller nye kjemiske modifikasjoner. Vi beskriver også en radioisotopisk merking, og etterfølgende isolering, med lipid A fra bakterielle celler for analyse ved hjelp av TLC. I forhold til MS-baserte protokoller, gir TLC en mer økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke brukes til å tilordne entydig lipid A kjemiske strukturer uten anvendelse av standarder med kjent kjemisk struktur. I løpet av de siste to tiårene isolering og karakterisering av lipid A har ført til en rekke spennende funn som har gitt bedre kunnskap om fysiologi av gramnegative bakterier, mekanismer for antibiotika motstandheten, menneskets medfødte immunrespons, og har gitt mange nye mål i utviklingen av antibakterielle forbindelser.

Introduction

Lipopolysakkarid (LPS) er en hoved ytterflate molekyl av nesten alle gram-negative organismer, og består av tre molekylære domener: en distal O-antigen polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og den membran-assosiert lipid A domain avsatt på den ytre paknings av ytre membran-dobbeltlag ^1,2. De lipid A domenet består av 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) rester og en lipid A-molekylære arter, der lipid A kan defineres som kloroform oppløselig del av LPS ved mild syrehydrolyse ^{1, 2.} Standarden lipid A-molekylet kan være kjemisk definert som en diglucosamine ryggrad som er hexa-acylerte og bis-fosforylert, i overensstemmelse med de store lipid A-artene ble observert i modellen organismen Escherichia coli (E. coli) ^1,2. Ni konstitutivt uttrykte gener, som bevares i hele gram-negative bakterier, er ansvarlig for produksjonen av lipid A domene (figur 1) ^1,2. De fleste bakterier har et ekstra sett med gener, som varierer i grad av fylogenetisk bevaring, som deltar i ytterligere kjemisk modifikasjon av lipid A ^3. Dephosphorylation, fjerning av acylkjeder, og tilsetning av kjemiske rester som for eksempel amino-sukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamine er de mest vanlig observerte aktiviteter (figur 1). Mange av de enzymer som er ansvarlige for lipid A modifikasjon blir direkte aktivert av miljøsignaler, slik som divalente kationer, eller deres ekspresjon er regulert av to komponent-regulator-systemer reaksjon ^3.

Anerkjennelse av lipid A arter av verten medfødte immunsystemet er mediert av Toll-like receptor 4/myeloid differensiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor ^4. Hydrofobe krefter mellom MD2 og lipid A acylkjeder, så vel som mellom TLR4 og 1 og 4 'fosfatgruppene lipid A fremmer sterke assosiasjon av leppenid A med TLR4/MD2 ^4,5. Modifikasjoner som endrer acyleringen staten eller negativ ladning av lipid A innvirkning TLR4/MD2 basert lipid En anerkjennelse og nedstrøms stimulering av det medfødte immunrespons aktivatorer NF-κB og mediatorer av inflammasjon som TNF-alfa og IL1-β ^6,7. Modifikasjoner som maskere den negative ladningen av lipid A også hindre bakteriedrepende kationiske antimikrobielle peptider fra binding til gram-negative celleoverflater ^3,8. Mange lipid A modifikasjoner er antatt å øke bakterie fitness under spesielle miljøforhold, for eksempel inne i menneske host eller i en økologisk nisje. Av denne grunn er mange modifikasjonsenzymer er attraktive mål på rasjonell utvikling av antimikrobielle forbindelser. Den kjemiske mangfold av lipid A-strukturer, med hensyn til organismer og / eller omgivelser, og de biologiske virkningene av disse forskjellige strukturer gjør strukturell karakterisering av lipid A en viktig oppgave i tHan studere av gram-negative bakterier.

Isolering av lipid A-molekyler fra hele bakterier omfatter utvinning av LPS fra bakteriecelleoverflaten, et hydrolytisk trinn å frigjøre lipid A, etterfulgt av en avsluttende renseprosess ^9-11. Den hyppigst siterte LPS utvinning prosedyren er hot-fenol vann utvinning prosedyre, først introdusert av Westphal og Jann ^10. Etter ekstraksjon hele LPS underkastes mild sur hydrolyse, som er kjemisk skiller Kdo fra 6'-hydroksyl av det distale glukosamin sukker av lipid A (figur 1). Mange fallgruver finnes for det varme-fenol vann prosedyre inkludert bruk av en høy fare reagens, blir behovet for å degradere ko-ekstraherte nukleinsyrer og proteiner, og flere dager for å fullføre protokoll ^10..

Vårt laboratorium har videreutviklet utvinning og isolering av lipid A som først utviklet av Caroff og Raetz ^12,13. Sammenlignet med varm fenol-vann-fremgangsmåten, idet fremgangsmåten er presentert her er raskere og mer effektiv, og kan tilpasses en lang rekke kulturvolumer fra 5 ml til flere liter. Videre, i motsetning til hot-fenol vann utdrag, ikke vår metode velger ikke for grov-eller glatt-typer av LPS, som gir optimal utvinning av lipid A arter. I vår-protokollen, er kjemisk lysering av hele bakterieceller utført med en blanding av kloroform, metanol og vann, hvor LPS kan bli pelletert ved sentrifugering. En kombinasjon av mild syrehydrolyse og oppløsnings ekstraksjoner (Bligh-Dyer) blir brukt til å frigjøre lipid A fra kovalent bundet polysakkarid. Metoden med Bligh and Dyer ble først brukt til utvinning av fettarter fra en rekke dyre-og plantemateriale ^14, modifisert her for å separere hydrolysert polysakkarid fra lipid A. I denne siste separasjonstrinn, kloroform oppløselige lipider selektivt fordeles i det nedre organiske fase. For ytterligere å rense lipid A, revers-fase elleranionisk bytterkolonne-kromatografi kan anvendes ^12.

Etter isolering av lipid A-arter fra hele celler, kan anvendes en rekke analysemetoder for å karakterisere den kjemiske strukturen av det isolerte materiale, slik som NMR, TLC og MS-baserte analyser. NMR gir mulighet for ikke-destruktiv strukturoppklaring, og gir strukturelle detaljer knyttet til glykosid bindinger, entydig tildeling av acylkjede stillinger, og tildeling av festeplasser for lipid A modifikasjoner som aminoarabinose eller phosphoethanolamine ^15-17. NMR-analyse av lipid A er ikke diskutert i vår protokollen, men er blitt beskrevet andre steder tilstrekkelig ^15,16. For rask analyse TLC baserte metoder brukes ofte, men ikke klarer å gi direkte informasjon om fine kjemiske struktur. MS baserte protokoller som er mest hyppig brukt metode for å karakterisere lipid A strukturer ^18,19. Matrix forbundet laser desorpsjon ionisering (MALDI)-MS er ofte brukt til utgangspunktet kartlegge intakte lipid A arter. Enkeltvis ladede ioner genereres fra analytten fremstilt i henhold til vår ekstraksjonsmetoder. Som kreves flere fine strukturanalyse, MS / MS-baserte metoder bevise mer informativ enn MALDI-MS. Koplet til Elektro ionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløper ioner er ytterligere fragmentert ved kollisjon indusert dissosiasjon (CID) eller ultrafiolett photodissociation (UVPD), å generere strukturelt informative produktioner ^18,20,21. Nøytrale tap produkter fra Lipid en forløper ioner er også ofte genereres under ESI-MS som gir et ekstra lag med strukturell informasjon.

Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist seg å være et uunnværlig og allsidig fremgangsmåte for belysning av lipid A-strukturer. Under MS / MS, blir ioner aktiveres for å gi en diagnostisk fragmenteringsmønster som kan brukes til å belyse den strukturen av forløperen ion. Den mest available MS / MS metoden er CID. Denne metoden gir fragmentioner via kollisjoner av den valgte forløper ion med en inert target gass, noe som er energi nedfall som fører til dissosiasjon. CID har vist seg en kritisk verktøy for tildeling av lipid A struktur for et bredt spekter av bakteriearter ^22-33.

Selv CID er den mest universelt implementert MS / MS metoden, genererer det et begrenset utvalg av produktioner. 193 nm UVPD er et alternativ, og komplementære MS / MS-metode. Denne metoden benytter en laser for å bestråle ioner, og absorpsjon av fotoner resulterer i energisering av ioner og etterfølgende dissosiasjon. Denne høyere energi MS / MS teknikk gir en mer variert utvalg av produkt ioner enn CID og dermed gir mer informative fragmentering mønstre. Spesielt gir UVPD informasjon om subtile endringer i lipid A arter basert på splittelsene i glycosidic, amin, acyl og CC indeksobligasjoner ^18,21,34.

Protocol

Alle løsningene bør bli fremstilt med ultrarent vann, og HPLC-kvalitet metanol og kloroform. Preparerte oppløsninger som inneholder organiske oppløsningsmidler slik som metanol, kloroform eller pyridin, og konsentrerte syrer eller baser skal fremstilles og brukes i henhold til et avtrekksskap. Alle løsningene kan bli lagret ved romtemperatur. Løse skal måles i en gradert glassylinder og lagret i glassflasker med løsemiddel PTFE-foret caps. For langtidslagring kloroform-holdige oppløsningsmidler bør lagres i to…

Representative Results

Canonical lipid A til E. coli-og Salmonella ente serovar typhimurium er et hexa-acylert disakkarid av glukosamin med fosfatgrupper i 1 – og 4 '-stillingene. Under vekst i rike medier (f.eks Luria Broth) en del av lipid A inneholder et pyrofosfat-gruppe ved 1-stillingen som gir en Tris-fosforylert arter 36 (figur 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonic syre), er festet på 6'-hydroksyl og tjener som en bro for å koble lipid A til de gjenværende karboh…

Discussion

I denne protokollen har vi inngående isolering av lipid A arter fra hele celler av bakterier, og beskrev TLC eller MS baserte analytiske metoder til kjemisk karakter dette isolerte materialet. Tandem massespektrometri er en kraftfull strategi for de novo strukturell karakterisering av biologiske forbindelser, og er verdifull for den kjemiske karakterisering av panoply av lipid A-molekyler som observeres i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiveringsmetoder som skaper ulike typer produktioner som gir v…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1