Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Summary

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Abstract

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie celular de las bacterias gram-negativas, depositado sobre la cara externa de la bicapa de la membrana externa. LPS se pueden subdividir en tres dominios: el O-polisacárido distal, un oligosacárido de núcleo, y el lípido A de dominio que consiste en un lípido una especie molecular y residuos de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO). El dominio lípido A es el único componente esencial para la supervivencia celular bacteriana. Después de su síntesis, el lípido A se modifica químicamente en respuesta a las tensiones ambientales tales como el pH o la temperatura, para promover la resistencia a compuestos antibióticos, y para evitar el reconocimiento por los mediadores de la respuesta inmune innata de acogida. El siguiente protocolo se detalla el aislamiento escala pequeña y gran del lípido A de bacterias gram-negativas. Material aislado después se caracteriza químicamente por cromatografía en capa fina (TLC) o la espectrometría de masa (MS). Además de láser asistida por matriz de desorción / ionización de tiempo de fluz (MALDI-TOF) de MS, también describe los protocolos MS en tándem para el análisis de los lípidos una especie molecular usando ionización por electrospray (ESI) acoplado a disociación inducida por colisión (CID) y recién empleados fotodisociación ultravioleta métodos (UVPD). Nuestros protocolos MS permiten la determinación inequívoca de la estructura química, de suma importancia para la caracterización de moléculas de lípido A que contienen las modificaciones químicas únicas o nuevas. También describimos el marcaje con radionúclidos, y el posterior aislamiento, del lípido A de las células bacterianas para el análisis por TLC. Relativa a los protocolos basados ​​en MS, la TLC proporciona un método de caracterización más económica y rápida, pero no se puede utilizar para asignar de forma inequívoca lípido A las estructuras químicas sin el uso de normas de estructura química conocida. En las últimas dos décadas el aislamiento y caracterización de lípido A ha dado lugar a numerosos descubrimientos interesantes que han mejorado nuestra comprensión de la fisiología de las bacterias gram-negativas, los mecanismos de resistencia a los antibióticoscia, la respuesta inmune innata humana, y han proporcionado a muchos nuevos objetivos en el desarrollo de compuestos antibacterianos.

Introduction

El lipopolisacárido (LPS) es la principal molécula de la superficie exterior de casi todos los organismos gram-negativas y consiste en tres dominios moleculares: un polisacárido distal antígeno O-, un oligosacárido de núcleo, y el lípido de membrana-asociada Un dominio depositado sobre la cara externa de la ^1,2 bicapa de la membrana externa. El lípido A de dominio se compone de 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (KDO) y un lípido residuos de una especie molecular, en donde el lípido A puede ser definida como la porción soluble en cloroformo de LPS después de la hidrólisis suave de ^{ácido-1, 2.} El lípido estándar Una molécula puede definirse químicamente como una columna vertebral diglucosamine que es hexa-acilada y bis-fosforilado; consistente con las principales especies de lípido A observadas en el organismo modelo Escherichia coli (E. coli) ^1,2. Nueve genes expresados ​​constitutivamente, conservados a lo largo de las bacterias gram-negativas, son responsables de la producción del lípido A de dominio (Figura 1) ^1,2. La mayoría de las bacterias tienen un conjunto adicional de los genes, que varían en el grado de conservación filogenética, que participan en la modificación química adicional del lípido A ^3. Desfosforilación, eliminación de cadenas de acilo, y la adición de restos químicos tales como amino azúcares (por ejemplo aminoarabinosa) y / o fosfoetanolamina son las actividades más comúnmente observados (Figura 1). Muchas de las enzimas responsables de lípidos Una modificación son activados directamente por señales ambientales, como cationes bivalentes, o su expresión está regulada por dos sistemas de respuesta del regulador de los componentes ^3.

Reconocimiento de especies de lípidos A por el sistema inmune innato de acogida está mediada por el receptor Toll-like factor de diferenciación 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor ^4. Fuerzas hidrófobas entre MD2 y el lípido A cadenas de acilo, así como entre TLR4 y los "grupos 1 y 4 de fosfato de lípido A promover la fuerte asociación de labioIdentificación A con TLR4/MD2 ^4,5. Las modificaciones que alteran el estado de acilación o la carga negativa del lípido A de lípidos basada impacto de TLR4/MD2 Un reconocimiento y estimulación aguas abajo de la respuesta inmune innata activadores de NF-kappa B y mediadores de la inflamación tales como TNF y IL-1-β ^6,7. Modificaciones que enmascaran la carga negativa del lípido A también impiden péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de la unión a bacterias Gram-negativas superficies celulares ^3,8. Muchas modificaciones lípido A son la hipótesis de aumentar la aptitud bacteriana bajo condiciones ambientales específicas, como en el interior del huésped humano o en un nicho ecológico. Por esta razón muchas enzimas de modificación son objetivos atractivos para el desarrollo racional de compuestos antimicrobianos. La diversidad química de las estructuras de lípido A, con respecto al organismo y / o el medio ambiente, y las implicaciones biológicas de estas diversas estructuras hacer la caracterización estructural de lípido A un esfuerzo importante en Testudie de bacterias gram-negativas.

Aislamiento de moléculas de lípidos A de bacterias enteras implica la extracción de LPS de la superficie celular bacteriana, un paso hidrolítica para liberar el lípido A, seguido de un procedimiento de purificación final ^9-11. El procedimiento de extracción más frecuentemente citada LPS es el procedimiento de extracción de agua caliente-fenol, primero introducido por Westphal y Jann ^10. Después de toda la extracción de LPS se somete a hidrólisis leve de ácido, que separa químicamente Kdo de la 6'-hidroxilo del azúcar glucosamina distal del lípido A (Figura 1). Existen numerosas trampas para el procedimiento de agua caliente-fenol incluyendo el uso de un reactivo de alta peligrosidad, la necesidad de degradar ácidos co-extraídos nucleicos y proteínas, y varios días se requieren para completar el protocolo ^10.

Nuestro laboratorio ha desarrollado aún más la extracción y aislamiento de lípido A como el desarrollado por primera vez por Caroff y Raetz ^12,13. En comparación con los procedimientos de agua caliente-fenol, el método presentado aquí es más rápida y eficiente, y se adapta a una amplia gama de volúmenes de cultivo de 5 ml a múltiples litros. Por otra parte, a diferencia de las extracciones de agua caliente de fenol, nuestro método no selecciona para rugosas o lisas-tipos de LPS, proporcionando una óptima recuperación de las especies de lípidos A. En nuestro protocolo, lisis química de las células bacterianas enteras se lleva a cabo utilizando una mezcla de cloroformo, metanol y agua, donde LPS pueden ser un sedimento por centrifugación. Una combinación de hidrólisis ácida suave y extracciones con disolvente (Bligh-Dyer) se utilizan para liberar lípido A de polisacárido unido covalentemente. El método de Bligh y Dyer se aplicó primero a la extracción de especies de lípidos a partir de una variedad de animales y tejidos vegetales ^14, modificado aquí para separar polisacárido hidrolizado de lípido A. En esta etapa de separación final, cloroformo lípidos solubles particionan selectivamente en la parte baja orgánica fase. Para purificar más lípido A, fase inversa ocromatografía de columna de intercambio aniónico se puede utilizar ^12.

Después del aislamiento de la especie A de lípidos a partir de células enteras, un número de métodos de análisis se puede utilizar para caracterizar la estructura química del material aislado tales como RMN, TLC, y el análisis basado en MS. RMN permite no destructivo elucidación estructural y proporciona detalles estructurales relacionados con enlaces glucosídicos, la asignación inequívoca de posiciones de la cadena de acilo, y la asignación de sitios de unión para los lípidos modificaciones A como aminoarabinosa o fosfoetanolamina ^15-17. El análisis de RMN de lípido A no se discute dentro de nuestro protocolo, pero se ha descrito adecuadamente en otras partes ^15,16. Para un rápido análisis TLC basan métodos se utilizan con frecuencia, pero no proporcionan información directa sobre la estructura química fina. Protocolos basados ​​MS son el método más frecuentemente utilizado para caracterizar las estructuras lipídicas A ^18,19. Matriz asociada desorción láser de ionización (MALDI)-MS se utiliza a menudo para estudiar inicialmente las especies intactas lípido. Iones de una sola carga se generan a partir del analito preparado de acuerdo con nuestros procedimientos de extracción. Como se requiere un análisis estructural más bien, los métodos basados ​​en MS / MS prueban más informativo que MALDI-MS. Junto a ionización por electrospray (ESI) de lípidos simple o múltiple cobrará un iones precursores son aún más fragmentado por disociación inducida por colisión (CID) o fotodisociación ultravioleta (UVPD), para generar iones producto estructuralmente informativos ^18,20,21. Productos para bajar de Neutrales de lípido A iones precursores también se generan con frecuencia durante ESI-MS proporciona una capa adicional de información estructural.

Espectrometría de masas en tándem (MS / MS) ha demostrado ser un método indispensable y versátil para la elucidación de las estructuras de lípido A. Durante MS / MS, los iones se activan para producir un patrón de fragmentación de diagnóstico que se puede utilizar para elucidar la estructura del ión precursor. El que más se available método MS / MS es CID. Este método produce fragmentos de iones a través de colisiones de la ión precursor seleccionado con un gas inerte de destino, lo que resulta en la deposición de energía que conduce a la disociación. CID ha demostrado ser una herramienta importante en la asignación de la estructura del lípido A para una amplia gama de especies bacterianas ^22-33.

Aunque CID es el método más universalmente aplicado MS / MS, se genera un conjunto limitado de iones de productos. 193 nm UVPD es una alternativa y un método de MS / MS complementaria. Este método utiliza un láser para irradiar iones, y la absorción de fotones resulta en la activación de los iones y posterior disociación. Esta energía superior técnica de MS / MS produce una gama más diversa de iones producto que CID y por lo tanto proporciona patrones de fragmentación más informativos. En particular, UVPD proporciona información sobre los cambios sutiles en las especies de lípidos A con base en divisiones en glicosídico, amina, acilo y CC bonos ligados ^18,21,34.

Protocol

Todas las soluciones deben prepararse con agua ultrapura y metanol grado HPLC y cloroformo. Soluciones de preparados que contengan disolventes orgánicos tales como metanol, cloroformo o piridina y ácidos o bases concentradas deben ser preparados y utilizados bajo una campana para vapores químicos. Todas las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente. Los solventes deben ser medidos en un cilindro de vidrio graduado y se almacenan en botellas de disolvente de vidrio con PTFE forrado casquillos. Para el alma…

Representative Results

Lípido A de E. canónica coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium es un disacárido hexa-acilada de glucosamina con grupos fosfato en las posiciones 1 – y 4 'posiciones. Durante el crecimiento en medios ricos (por ejemplo, caldo de Luria) una porción del lípido A contiene un grupo pirofosfato en la posición 1 produciendo una especie-tris fosforilada 36 (Figura 1). Kdo (-D-manno-octulosonic 3-desoxi ácido), está unido en la …

Discussion

En este protocolo hemos detallado el aislamiento de especies de lípido A partir de células enteras de bacterias, y descrito TLC o métodos analíticos basados ​​en MS para caracterizar químicamente el material aislado. Tandem espectrometría de masas es una estrategia poderosa para la caracterización estructural de novo de compuestos biológicos, y tiene un valor incalculable para la caracterización química de la panoplia de moléculas de lípido A se observan en la naturaleza. CID y UVPD son dos mét…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1