שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.
דרוזופילה האירה את ההבנה של הבסיס הגנטי של התפתחות מחלה ורגילה שלנו בעשורים האחרונים, וכיום היא ממשיכה לתרום הרבה מאוד להבנה של מחלות מורכבות 1-7 שלנו. התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא אירוע מורכב 8 וכבר הדגם בדרוזופילה כדי לעזור לנו להבין טוב יותר את הבסיס הגנטי של מחלה זו 9. כאן אני מציג פרוטוקול פשוט כדי לגרום גנטי, להתבונן ולאחר מכן לנתח את ההתפתחות של גידולים בזחלי דרוזופילה. טכניקת האינדוקציה הגידול מבוססת על מערכת MARCM 10 ומנצלת את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל, ראס V12 ואובדן של גנים קוטביות תא (שרבט, דיסקי זחלים ענק גדולים וקטלניים) כדי ליצור גידולים פולשניים 9. אני אדגים כיצד ניתן דמיינו גידולים אלה בזחלים ללא פגע ואז איך אלה יכולים להיות גזורים החוצה לניתוח נוסף. הפרוטוקול פשוטים שהוצג כאן צריך לעשות את זה אפשרי עבור טכניקה זו כדי להיות מנוצל על ידי חוקרים מעוניינים בהבנת תפקידו של גן בפלישת גידול.
התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא תהליך חכם צעד שמאופיין בהתחמקות ממנגנוני הגנה בגוף נוכחי 8. לדוגמא תאים סרטניים בגוף חייבים להיות מסוגלים להתחמק ממערכת החיסון ואפופטוזיס, פריצת דרך המטריצה תאית מיוחדת (ECM) הנקראת קרום במרתף, ולהתגבר על כל פקדים חברתיים שהוטלו על ידי התאים המקיפים את 8. זוהי דרך התקדמות חכמה צעד שהתאים הסרטניים לרכוש את היכולת להעביר וליישב אתרים מרוחקים בתהליך הנקרא גרורות. ההבנה של אופן שבו התאים הסרטניים מתגבר על החסמים שהוטלו על ידי הגוף שלנו היא עדיין בחיתוליו, לעומת זאת, התמונה המצטיירת ממחקר שנעשתה עד כה מצביע על שימוש חוזר של תהליכים התפתחותיים נורמלים ומסלולי איתות על ידי התאים הסרטניים 11-13.
זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster תרם מאוד לunderstanding של התפתחות נורמלית ומחלה באמצעות שימוש בטכניקות גנטיות מתוחכמות שפותחו בעשורים האחרונים 14-17. באמצעות mutagenesis וכלי ביטוי יתר שהגענו להבנה טובה יותר של אונקוגנים שונים וגני מדכאי סרטן 18-22. עם זאת, גרורות סרטניים היא תוצאה של שיתוף פעולה בין כמה נגעים גנטיים שנחקר בעיקר במודלים של תרבית תאי 23,24 כמו גם מודלים xenograft שונים 25-27. יש מודלים אלו אם כי עוצמה המגבלות שלהם כמו שהם לא לחקות לחלוטין את התנאים נמצאו בכל יצור חי. יתר על כן, מודלים מהונדסים זמינים בעכברים הם מסורבלים ולא תורם לניתוח גנטי של התנהגות 28,29 פולשנית. מספר מחקרים ניסו להבין פלישה של תאים סרטניים בדרוזופילה 30,31. טכניקות אלו בעיקר לנצל השתלה של גידולים ראשוניים למארחים ולאחר מכן מסתמכות על מעקב טרהnsplanted גידולים לפלישה לרקמות שכנות 32,33. טכניקה רבת עוצמה בשם MARCM 10 הותאמה על ידי Pagliarini ושו למודל פלישת גידול בדרוזופילה 9. דוגמנות גנטית אלגנטית זה של פלישת גידול ניצלה את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל ואובדן קוטביות תא. כוחו של דוגמנות זה טמון בעובדה שהגידולים פולשניים נוצרים באורגניזם שלם ובכך לעקוף את הצורך בהשתלה של רקמות. כדי להביא לשיתוף פעולה בשעור, אונקוגן הופעל כמו ראס V12 מתבטא בשיבוטים של תאים בדיסק עיניים מחושים הזחל. כתוצאה מטכניקת MARCM שיבוטים אלה גם מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה קלה ונעשים הומוזיגוטים למוטציות קוטביות תא כמו זחלים קטלניים ענק, שרבט, ודיסקים גדולים. התוצאה היא ה-GFP מתויגת גידולים פולשניים ב מורכב cephalic. בדו"ח זה אניתדגים כיצד לגרום, ולחזות גידולים פולשניים אלה הן בהקשר של זחלים שלמים והמורכב בcephalic גזור החוצה. האינדוקציה הגידול המובאת כאן מנצלת חומרים כימיים בכרומוזום השני של דרוזופילה. בטבלה 2, אני מספק רישום של מניות על כרומוזומים X ו -3 שניתן לנצלם לאותה מטרה. אני מאמין כי פרוטוקול פשוט זו יהפוך את הטכניקה הזו נגישה לחוקרים המעוניינים בהבנת הבסיס המולקולרי של התקדמות גידול.
הסרטן הוא מחלה מורכבת עם הבנה הרבה יותר טובה היום מאשר בעבר. עם זאת, הרבה עדיין צריכה ללמוד והסביר לפני שיש לנו תמונה של המנגנונים שלמה. הפרוטוקול פשוט שהוצג כאן מאפשר לגרום גנטי גידולים שפירים ופולשני בהאורגניזם כולו ולאחר מכן ללמוד את הביולוגיה הקשורים להתפתחות של …
The authors have nothing to disclose.
מחקר במעבדה שלי הוא נתמך על ידי משרד wku של קופות הפעלת ביולוגיה, מחקר wku קרן RCAP-אני מעניק # 11-8032 ועל ידי מענק KBRIN-AREA במימון באמצעות מענק הורה מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליות של המכון הלאומי בריאות תחת מספר הפרסים 5P20GM103436-13. אני רוצה גם להודות ד"ר טיאן שו במעבדה שהכיר לי את הטכניקה הזאת ואת ד"ר ריימונד Pagliarini שהוקמה בטכניקה זו ראשונה במעבדה שו.
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |