Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.
Abstract
Drosophila heeft ons begrip van de genetische basis van de normale ontwikkeling en de ziekte van de afgelopen decennia en vandaag het blijft enorm bijdragen aan ons begrip van complexe ziekten 1-7 verlicht. Progressie van tumoren van een goedaardige van een uitgezaaide staat is een complex evenement 8 en is gemodelleerd in Drosophila om ons te helpen beter inzicht in de genetische basis van deze ziekte 9. Hier presenteer ik een eenvoudig protocol om genetisch te induceren, observeren en vervolgens de progressie van tumoren in Drosophila larven analyseren. De tumor inductie techniek is gebaseerd op het marcm systeem 10 en gebruikt de samenwerking tussen een geactiveerde oncogene Ras V12 en verlies van celpolariteit genen (opgekladde, schijven groot en dodelijke reuze larven) invasieve tumoren 9 genereren. Ik laten zien hoe deze tumoren kan worden gevisualiseerd in de intacte larven enhoe deze kunnen worden ontleed uit voor verdere analyse. De vereenvoudigde protocol hier gepresenteerde moet het mogelijk deze techniek wordt gebruikt door onderzoekers vindt het begrijpen van de rol van een gen in tumor invasie.
Introduction
Progressie van tumoren van een goedaardige naar een metastatische toestand is een stapsgewijze proces dat gekenmerkt wordt door ontwijking van beschermende mechanismen in het lichaam 8. Bijvoorbeeld tumorcellen in het lichaam moet kunnen apoptose en het immuunsysteem te omzeilen, doorbraak gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) genoemd basaalmembraanziekte en overwinnen eventuele sociale controle die door de omringende cellen 8. Het is door een stapsgewijze progressie die de kankercellen verwerven het vermogen om te migreren en te koloniseren verre plaatsen in een proces genaamd metastase. Ons begrip van hoe de tumorcel overwint de beperkingen die het lichaam barrières is nog in de kinderschoenen, maar de opkomende beeld uit onderzoek gedaan tot nu toe wijst op een herhaald gebruik van normale ontwikkelingsprocessen en signaalwegen door de kankercellen 11-13.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft enorm bijgedragen aan onze understanding van de normale ontwikkeling en ziekte door het gebruik van geavanceerde genetische technieken ontwikkeld in de afgelopen tientallen jaren 14-17. Met behulp van mutagenese en overexpressie tools die we zijn aangekomen op een beter begrip van verschillende oncogenen en tumor suppressor genen 18-22. Echter, tumormetastase is een gevolg van de samenwerking tussen verschillende genetische laesies die is voornamelijk bestudeerd in celkweekmodellen 23,24 en verschillende xenograftmodellen 25-27. Deze modellen maar krachtig hebben hun beperkingen omdat zij niet volledig nabootsen omstandigheden in een levend organisme. Bovendien transgene modellen beschikbaar in muizen zijn omslachtig en niet bevorderlijk voor de genetische analyse van invasief gedrag 28,29. Verschillende studies hebben geprobeerd om de invasie van tumorcellen te begrijpen in Drosophila 30,31. Deze technieken voornamelijk gebruik maken van transplantatie van primaire tumoren aan hosts en dan vertrouwen op het volgen van de transplanted tumoren voor invasie van aangrenzende weefsels 32,33. Een krachtige techniek genaamd marcm 10 werd aangepast door Pagliarini en Xu model tumor invasie in Drosophila 9. Dit elegante genetisch model van tumorinvasie benut de samenwerking tussen een geactiveerde oncogen en verlies van celpolariteit. De kracht van deze modellen is het feit dat de invasieve tumoren zijn gemaakt in een intact organisme dus omzeilen de noodzaak voor transplantatie van weefsels. Om de oncogene samenwerking brengen, wordt een geactiveerd Ras oncogen als V12 uitgedrukt in klonen van cellen in het larvale oog antennal disc. Door de marcm techniek deze klonen ook aangeduid met groen fluorescerend eiwit (GFP) voor eenvoudige visualisatie en zijn homozygoot voor celpolariteit mutanten als dodelijk reuze larven, krabbelde en grote schijven gemaakt. Het resultaat GFP gelabeld invasieve tumoren in de Cephalic complex. In dit rapport Idemonstreren hoe te induceren, en visualiseer deze invasieve tumoren, zowel in het kader van een intact larven en in ontleed uit cephalic complex. De tumor inductie gepresenteerde gebruikt reagentia op het tweede chromosoom van Drosophila. In tabel 2 geef ik een overzicht van voorraden X en 3e chromosomen die kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel. Ik geloof dat deze vereenvoudigde protocol deze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van de moleculaire basis van de progressie van de tumor zal maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanker is een complexe ziekte met een veel beter inzicht om dan in het verleden. Er moet echter nog veel worden geleerd en uitgelegd voordat we een volledig beeld van de onderliggende mechanismen. De eenvoudig protocol hier gepresenteerde maakt het mogelijk om genetisch induceren goedaardige en invasieve tumoren in een geheel organisme en bestuderen biologie geassocieerd met de progressie van tumoren in dit model. De meeste bestaande technieken Drosophila en andere organismen of gebruiken een celcultuur gebasee…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in mijn laboratorium wordt ondersteund door de WKU departement Biologie opstarten fondsen, WKU Research Foundation RCAP-Ik geven # 11-8032 en door een KBRIN-AREA subsidie gefinancierd door een ouder subsidie van het Nationaal Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes van Volksgezondheid onder nummer award 5P20GM103436-13. Ik zou ook graag Dr Tian Xu in wiens laboratorium ik werd voorgesteld aan deze techniek en dr. Raymond Pagliarini die als eerste deze techniek in de Xu laboratorium erkennen.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
References
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Génétique. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Génétique. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Génétique. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
