Approcci genetici in avanti<em> Chlamydia trachomatis</em
Summary
Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.
Abstract
Chlamydia trachomatis, l'agente eziologico di malattie sessualmente trasmissibili e infezioni oculari, rimane poco caratterizzato per la sua intrattabilità di trasformazione sperimentale con il DNA ricombinante. Abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica in C. trachomatis, nonostante la mancanza di strumenti di genetica molecolare. Il nostro metodo prevede: i) la mutagenesi chimica per generare rapidamente ampie librerie di mutanti geneticamente definiti con fenotipi distinti; ii) il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) per mappare le lesioni genetiche sottostanti e di trovare associazioni tra gene mutato (s) e.. un fenotipo comune,. iii) generazione di ceppi ricombinanti attraverso la co-infezione di cellule di mammifero con batteri tipo mutante e selvaggio. Di conseguenza, siamo stati in grado di stabilire relazioni causali tra genotipi e fenotipi. L'accoppiamento di variazione del gene indotto chimicamente e WGS per stabilire associazioni genotipo-fenotipo correlativi should essere ampiamente applicabile alla lunga lista di medico ed ecologicamente importanti microrganismi attualmente intrattabili per l'analisi genetica.
Introduction
Le intracellulare obbligato batterio Chlamydia trachomatis conti per una stima di 2,8 milioni di infezioni del tratto genitale ogni anno negli Stati Uniti (Center for Disease Control) con associata sequele come la malattia infiammatoria pelvica, gravidanze ectopiche e sterilità (1). Chlamydia spp hanno un unico fisiologia con un ciclo di sviluppo bifasico costituito da due forme: il corpo elementare infettiva ma non replicante (EB) e il corpo reticolato non infettiva ma replicativa (RB). Infezione inizia con l'attaccamento di EBS per cellule epiteliali seguite da endoctyotosis (2). All'interno di un vacuolo di membrana chiamato un'inclusione, EBS differenziarsi in forma RB, che poi si replica per scissione binaria. A metà ciclo, transizioni RBS nuovo in EBS, che vengono poi espulse nello spazio extracellulare di iniziare nuovi cicli di infezione quando i lisi della cellula ospite (3).
C. trachomatis èrefrattario alla manipolazione di routine con strumenti genetici molecolari standard, ad esempio la sostituzione mirata del gene, trasposoni, e fagi trasduttori, che sono stati al centro di molti studi di genetica batterica, non è chiaro in che misura i singoli geni Chlamydia contribuiscono alla evasione di immunità innata , l'acquisizione di nutrienti, le transizioni evolutive, o altri processi importanti per la sopravvivenza del patogeno all'interno di un ospite eucariotica (4). Di conseguenza, questo patogeno rimane poco caratterizzato, nonostante la sua importanza clinica.
I genomi di Chlamydia spp. sono relativamente piccole (~ 1 Mb) (5), con più specie e biotipi sequenziati usando Avanti tecnologie di sequenziamento generazione. Analisi genomica comparativa di WGS ha fornito intuizioni uniche nella evoluzione della specie Chlamydia e il loro adattamento per l'uomo (6-8) e in qualche misura ha fornito alcune informazioni circa la potenziale funzione di fattori di virulenza (9, 10). Tegli diversità genetica visualizzata da isolati clinici non fornisce la risoluzione richiesta per mappare sistematicamente la funzione della maggior fattori di virulenza, presumibilmente perché tali mutazioni in geni sarebbero stati prontamente contro selezionato. Senza effetti confondenti di selezione naturale, variazione del gene mutageno indotto, insieme con dosaggi definiti che i difetti misurano in virulenza, possono ampliare lo spettro di mutazioni che possono essere esaminati. Mutageni chimici, in particolare, sono utili in quanto possono generare null, condizionale, hypomorphic (ridotta funzione), e hypermorphic (guadagno di funzione) alleli. Con l'arrivo delle tecnologie di sequenziamento del genoma-robusti di prossima generazione, tali mutazioni possono essere facilmente identificati e mappati. In questo modo, le associazioni forti può essere fatta tra mutazioni in un gene o genetico percorso ed un fenotipo comune, consentendo l'applicazione di approcci genetici avanti.
Le sequenze del genoma dei ceppi clinici hanno rivelato mosaicismo bra sierotipi ei loci di ricombinazione frequente (11). L'evidenza empirica di ricombinazione è stata dimostrata attraverso la co-infezione di due diversi ceppi resistenti agli antibiotici e la selezione di progenie ricombinante resistente doppio, che si è rivelato di avere contributi genetici di entrambi i ceppi (12, 13). Così, scambio genetico tra ceppi wild type e mutanti in un ambiente co-infezione permette segregazione delle mutazioni indotti chimicamente per individuare il gene alterato che porta al fenotipo osservato.
Qui si descrive un metodo per effettuare analisi genetica in Chlamydia base di mutagenesi chimica, WGS, e un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate (14) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa metodologia soddisfa i requisiti di base per l'analisi genetica in quanto stabilisce il collegamento tra genotipi e fenotipi. È importante sottolineare che questo è realizzato senza l'ausilio di strumenti molecolari convenzionali per la trasformazione del DNA ricombinante e inattivazione inserzionale di geni nei batteri, che è spesso una tappa limitante nell'analisi della funzione del gene in microbi non-modello.
Un passo fondamentale è quello di garantire clonalità d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
