الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار
Summary
ونحن الخطوط العريضة لطرق فعالة وسريعة العزلة / ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة قابلة للحياة من القشرة الدماغية حديثي الولادة والحبل الشوكي الكبار. تشريح والطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية يمكن إنجازه في غضون 90 دقيقة، مع موسم الحصاد دبقية اللاحقة التي تجري ~ 10 يوما بعد تشريح الأولي.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي المقيم الخلايا الشبيهة بلعم من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وعلى هذا النحو، لهما أدوار بالغة الأهمية في العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS نضوج في التنمية، والتصلب المتعدد، وإصابات الحبل الشوكي. ويمكن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتجنيدهم للعمل بسبب الاصابة العصبية أو التحفيز، مثل تلف المحاور ينظر في مرض التصلب العصبي المتعدد أو الصدمة الدماغ الدماغية الناجمة عن السكتة الدماغية. ويعتقد أن هذه الأعضاء مناعيا من الجهاز العصبي المركزي أيضا أن يكون الأدوار في اللدونة متشابك في ظل ظروف غير مرضية. نحن توظيف بروتوكولات لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة حديثي الولادة والكبار والتي تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من أرقام الهواتف المحمولة قابلة للحياة مع التقليل من المتغيرات التباس، مثل وجود CNS الأخرى أنواع الخلايا والحطام خلية ثقافة. نحن نستخدم مكونات الجهاز العصبي المركزي كبير وملحوظ بسهولة (مثل القشرة، شرائح الحبل الشوكي)، مما يجعل العملية برمتها مجدية وقابلة للتكرار. استخدام الخلايا الكبارS هو البديل المناسب لاستخدام الأطفال حديثي الولادة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، كما درس العديد من الأمراض تؤثر في الأساس على الحبل الشوكي بعد الولادة. هذه الأنظمة الثقافة هي أيضا مفيدة لاختبار تأثير مباشرة من المركبات التي قد تمنع أو إما تعزيز التنشيط دبقية. منذ تفعيل دبقية صغيرة يمكن أن تشكل نتائج مرض في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وهناك حاجة لفي نظم المختبر في الخلايا الدبقية الصغيرة التي حديثي الولادة والكبار يمكن تربيتها ودراستها.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي، تشبه بشكل وثيق الضامة الطرفية في البنية والوظيفة 1. وقد ثبت مؤخرا أن الخلايا دبقية بعد الولادة مستمدة من الأسلاف النخاعي بدائية ويتم إنشاؤها قبل اليوم الثامن من مرحلة التطور الجنيني، تقلب فكرة سابقة أن الأسلاف المكونة للدم بعد الولادة هي مصدر الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ بالغ 2. أنها تلعب دورا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية ويمكن أن تستجيب بسرعة للعدوى أو إصابة عن طريق الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات أو المضادة للالتهابات 3. وهكذا الخلايا الدبقية الصغيرة تشمل وحدة قائمة بذاتها في الجهاز العصبي المركزي التي يمكن التلاعب بها لتؤثر على تطور المرض. تطوير أساليب قوية وقابلة للتكرار لعزل وثقافة الأطفال حديثي الولادة أو الكبار خلايا دبقية المهم أن الدراسات المستقبلية.
ومن المعروف الخلايا الدبقية الصغيرة ليكونوا لاعبين الحرجة في عدد من الحالات المرضية في الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، رولES آخذة في الظهور للخلايا في نمو الدماغ العادي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة يبلعم فائض الخلايا العصبية السلف من التلفيف المسنن من الحصين 1 و 4. الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أيضا أن تعدل العديد من الحالات العصبية التي تؤثر على الحبل الشوكي، مثل MS، ألم الأعصاب، وإصابات الحبل الشوكي 5-7. الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي تتفاعل بشكل مختلف مقارنة مع الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ استجابة لإشارات التنشيط 8، 9، ربما بسبب وجود خلافات في البيئة المحلية. وبالتالي فإنه من المهم لإنشاء المناسبة في نظام المختبر للثقافة ودراسة الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي. الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة إنتاج أكثر بكثير من الموالية للالتهابات خلوى أكسيد النيتريك مقارنة مع الخلايا البالغة بعد في التحفيز المختبر مع الإنترفيرون γ أو TNF-A 10،11 مزيد من تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام خلايا بالغة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق بعض الأمراض.
بروتوكول نستخدمها في المختبر لCUlture الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة هو الاختلاف من الأساليب الحديثة التي تستخدم اهتزاز الثقافات الدبقية المختلطة في محاولة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من سطح خلية ثقافة قارورة 12. نحن أيضا تصف طريقة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة من البالغين الماوس الحبل الشوكي على أساس بروتوكول وصف لأول مرة من قبل ييب، وآخرون 13. يوفر هذا الأسلوب وسيلة أسرع لخلايا بالغة ثقافة مقارنة البروتوكولات الأخرى المتاحة 14. إعداد الناتج هو 70٪ الخلايا الدبقية الصغيرة، وتتكون النسبة الباقية من الخلايا النجمية. على الرغم من أن نقاء ثقافتنا هو أقل بالمقارنة مع غيرها من وسائل نشر 13، وهذا النظام الثقافة هي مفيدة لإستكشاف دبقية في استجابة الثقافة لمختلف المحفزات تفعيل وكذلك لدراسة الأمراض التي تؤثر بشكل رئيسي في النخاع الشوكي والتي قوية استجابة التهابية هو السمة الرئيسية.
وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي وصفها ستوني بروك اجلامعاتتاي IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الدبقية الصغيرة تعدل CNS السير العادي فضلا عن الاستجابات الالتهابية لمختلف الأمراض. وقد تورط إعادة عرض متشابك وظيفية من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على التوازن الطبيعي للدماغ 15. خلال تتالي العصبية يشاركون في إزالة الخلايا العصبية السلف من الت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء المختبر Tsirka لنصائحهم وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل R01NS42168 إلى المجموعة، 12PRE12060489 إلى RB، وهو NSF-3MT IGERT وتيرنر أطروحة الزمالة إلى LT، و NSF-3MT IGERT إلى JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
