Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים
Summary
אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.
Abstract
Microglia הם התאים דמויי מקרופאג התושבים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), וככזה, יש תפקידים חשובים וקריטי בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS התבגרות בפיתוח, טרשת נפוצה, ופגיעה בחוט השדרה. יכול להיות מופעל microglia וגייס לפעולה על ידי פציעה או גירוי עצבי, כגון פגיעה בaxonal ראתה ב-MS או טראומה המוחית איסכמי כתוצאה משבץ מוחי. חברי immunocompetent אלה של מערכת העצבים המרכזית גם הם חשבו שיש תפקידים בפלסטיות הסינפטית בתנאים שאינם פתולוגיים. אנו מעסיקים פרוטוקולים לmicroglia culturing מן רקמות היילודים ומבוגרים שהמטרה למקסם את המספרים הסלולריים קיימא תוך מזעור משתנים מבלבלים, כגון נוכחות של סוגי תאים במערכת העצבים המרכזית ופסולת אחרים תרבית תאים. אנו משתמשים ברכיבים גדולים ולהבחין בקלות במערכת העצבים המרכזית (לדוגמה: קליפה, פלחי חוט השדרה), מה שהופך את כל התהליך אפשרי לשחזור. השימוש בתא בוגרים הוא חלופה מתאימה לשימוש בmicroglia מוח ילוד, כפי שפתולוגיות רבות למדה בעיקר משפיעות על חוט השדרה לאחר הלידה. מערכות התרבות אלה הן גם שימושיות עבור ישירות בדיקת ההשפעה של תרכובות שיכולים גם לעכב או לקדם את הפעלת microglial. מאז הפעלת microglial יכולה לעצב את התוצאות של מחלה של מערכת העצבים המרכזית למבוגרים, יש צורך במערכות מבחנה שבה יכול להיות מתורבת microglia יילודים ומבוגרים ולמדו.
Introduction
Microglia הם התאים החיסוניים המקומיים של מערכת העצבים המרכזית, המזכירים באופן הדוק ביותר מקרופאגים היקפיים במבנה ותפקוד 1. זה כבר הוכיח לאחרונה כי תאי microglial לאחר לידה נובעים מאבות מיאלואידית פרימיטיביות ונוצרים לפני היום השמיני של עובר, הפילו את הרעיון הקודם שאבות hematopoietic לאחר לידה הם המקור של microglia במוח הבוגר 2. הם משחקים תפקידי מפתח במספר מחלות נוירולוגיות ויכולים להגיב במהירות לזיהום או פגיעה על ידי שחרור הפרו ציטוקינים דלקתיים ואנטי דלקתיים 3. לפיכך microglia להקיף יחידה עצמאית של מערכת העצבים המרכזית שניתן להשפיע להשפיע התקדמות מחלה. פיתוח שיטות חזקות ולשעתק לבודד ותאי microglial ילוד או מבוגר תרבות חשוב למחקרים עתידיים.
Microglia ידוע להיות שחקנים קריטיים במספר פתולוגיות מוחיות. לאחרונה, רולes הם מתעוררים לתאים בהתפתחות מוח הנורמלי ולתפקד כתאי microglia phagocytose עודפים עצביים אב מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 1, 4. Microglia יכול גם לווסת את מספר תנאי נוירולוגיות שמשפיעים על חוט השדרה, כגון טרשת נפוצה, כאב נוירופתי, ופגיעה בחוט השדרה 5-7. microglia בעמוד השדרה מגיב באופן שונה בהשוואה למוח microglia בתגובה לאותות הפעלה 8, 9, כנראה בשל הבדלים בסביבה המקומית. לכן חשוב להקים מתאים במערכת במבחנה לתרבות וללמוד microglia חוט השדרה. microglia הילוד לייצר באופן משמעותי יותר של תחמוצת חנקן ציטוקינים פרו דלקתית בהשוואה לתאים בוגרים לאחר גירוי במבחנה עם IFN-γ או TNF-10,11 נוסף המדגיש את הצורך בשימוש בתאי בוגרים ללמוד microglia בהקשר של מחלות מסוימות.
הפרוטוקול אנחנו מעסיקים במעבדה למ"קmicroglia ילוד lture הוא וריאציה של השיטות האחרונות אשר מנצלים רועד של תרבויות גליה מעורבות במאמץ להסיר את microglia מפני השטח של תא בקבוק התרבות 12. אנחנו גם מתארים שיטה לתרבות microglia מחוט השדרה למבוגרים העכבר מבוסס על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי ייפ, ואח' 13. שיטה זו מספקת דרך מהירה לתאים בוגרים תרבות בהשוואה לפרוטוקולים זמינים 14 אחרים. ההכנה המתקבלת היא 70% microglia; האחוז הנותר מורכב מהאסטרוציטים. למרות טוהר התרבות שלנו הוא נמוך יותר בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו 13, מערכת התרבות זו היא שימושית לחקר תרבות microglial בתגובה לגירויים הפעלה שונים, כמו גם למחקר של מחלות שבעיקר משפיעים על חוט השדרה ושבו חזק תגובה דלקתית היא תכונה עיקרי.
כל הפרוטוקולים שתוארו כבר אושר על ידי סטוני ברוק Universiטאי IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia לווסת את מערכת העצבים המרכזית תפקוד תקין, כמו גם תגובות דלקתיות לפתולוגיות שונות. שיפוץ הסינפטי פונקציונלי על ידי microglia היה מעורב בשמירה על הומאוסטזיס המוח הנורמלי 15. במהלך מפל neurogenic הם משתתפים באישור של תאים עצביים מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 4, 16. לכ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברים במעבדה Tsirka לעצתם והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי R01NS42168 להגדיר, 12PRE12060489 לRB, IGERT NSF-3MT ומלגת דוקטורט טרנר לשעון מקומי, וNSF-3MT IGERT לJCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
