Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l'adulte

Summary

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Abstract

Les microglies sont les cellules de type macrophage résident du système nerveux central (SNC) et, à ce titre, ont un rôle d'une importance cruciale dans les processus physiologiques et pathologiques tels que SNC maturation dans le développement, la sclérose en plaques et les lésions de la moelle épinière. Microglie peut être activé et recruté à l'action par une blessure ou une stimulation neuronale, tels que des lésions axonales vu dans MS ou un traumatisme cérébral ischémique résultant d'une attaque. Ces membres immunocompétentes du SNC sont également pensé à avoir un rôle dans la plasticité synaptique dans des conditions non pathologiques. Nous utilisons des protocoles pour la microglie de culture des tissus néonatales et adultes qui visent à maximiser le nombre de cellules viables tout en minimisant les facteurs de confusion, tels que la présence d'autres types de cellules du système nerveux central et les débris de culture cellulaire. Nous utilisons des composants du système nerveux central, grandes et facilement discernable (par exemple cortex, les segments de la moelle épinière), ce qui rend l'ensemble du processus réalisable et reproductible. L'utilisation de la cellule adultes est une alternative appropriée à l'utilisation de la microglie du cerveau néonatal, comme beaucoup de pathologies étudiées touchent principalement la moelle épinière postnatal. Ces systèmes de culture sont également utiles pour tester directement l'effet des composés qui peuvent inhiber ou promouvoir activation de la microglie. Depuis activation de la microglie peut façonner les résultats de la maladie dans le SNC adulte, il existe un besoin pour des systèmes in vitro dans lequel la microglie néonatale et adulte peut être cultivée et étudiée.

Introduction

Microglies sont les cellules immunitaires résidentes du SNC, ressemblant plus étroitement macrophages périphériques dans la structure et la fonction ^1. Il a été récemment démontré que les cellules microgliales postnatale proviennent de progéniteurs myéloïdes primitives et sont générés avant le huitième jour de l'embryogenèse, bouleversant la notion précédente qui progéniteurs hématopoïétiques postnatales sont la source de la microglie dans le cerveau adulte ^2. Ils jouent un rôle clé dans plusieurs maladies neurologiques et peuvent réagir rapidement à une infection ou une blessure en libérant des cytokines pro-inflammatoires ou anti-inflammatoire ^3. Ainsi microglie englober une unité autonome dans le système nerveux central qui peuvent être manipulés à affecter la progression de la maladie. Développer des méthodes robustes et reproductibles pour isoler et cultiver les cellules microgliales néonatale ou adulte est important pour de futures études.

Les microglies sont connus pour être des acteurs essentiels dans un certain nombre de pathologies cérébrales. Plus récemment, roles sont en train d'émerger pour les cellules dans le développement normal du cerveau et de la fonction que les cellules microgliales phagocytent excès de neurones progéniteurs du gyrus denté de l'hippocampe ^{1, 4.} Microglie peut aussi moduler plusieurs conditions neurologiques qui affectent la moelle épinière, comme MS, les douleurs neuropathiques et les blessures de la moelle épinière ^5-7. Spinal microglies de la moelle réagissent différemment par rapport à la microglie du cerveau en réponse à des signaux d'activation ^{8, 9,} probablement en raison de différences dans l'environnement local. Il est donc important de mettre en place un système in vitro approprié à la culture et à étudier les microglies de la moelle épinière. Microglie néonatale produisent beaucoup plus de l'oxyde de cytokines pro-inflammatoires nitrique par rapport aux cellules adultes après stimulation in vitro avec l'IFN-γ ou TNF-a ^10,11 soulignant la nécessité d'utiliser des cellules adultes pour étudier la microglie dans le cadre de certaines maladies plus loin.

Le protocole que nous utilisons en laboratoire pour culture microglie néonatale est une variante de méthodes récentes qui utilisent tremblement de cultures mixtes gliales dans un effort pour supprimer les microglies de la surface du flacon de culture cellulaire ^12. Nous décrivons également une méthode de culture microglies de la moelle épinière de souris adulte sur base d'un protocole d'abord décrit par Yip, et al ^13. Cette méthode fournit un moyen plus rapide de cellules adultes de la culture par rapport à d'autres protocoles disponibles ^14. La préparation obtenue est de 70% microglie, le pourcentage restant se compose d'astrocytes. Bien que la pureté de notre culture est plus faible par rapport à d'autres méthodes publiées ^13, ce système de culture est utile pour explorer la microglie dans la réponse de la culture à divers stimuli d'activation ainsi que pour l'étude des maladies qui affectent principalement la moelle épinière et dans lequel une forte réponse inflammatoire est une caractéristique principale.

Tous les protocoles décrits ont été approuvés par la Stony Brook University IACUC.

Protocol

1. Dissection (jour 0) Induire une anesthésie à P0-2 souriceaux d'hypothermie. Essuyez les têtes des chiots avec un Kimwipe trempé dans l'éthanol à 70% pour désinfecter les tissus. Enlevez les têtes avec une paire de ciseaux, avec 4 petits par plaque de culture de 10 cm. Placez les têtes dans une boîte de Pétri contenant le tampon glacée Hank. Ancrer les têtes avec une pince courbe à travers les orbites et retirer délicatement la peau qui recouvre le crâne avec micr…

Representative Results

Un exemple de cellules de la microglie au repos et activées est illustré à la figure 1. La microglie ont été visualisée 24 heures après placage (figure 1a) et présentent ramifié morphologie (au repos). L'exposition au réactif d'amorçage, le lipopolysaccharide (LPS) bactériens résultats des changements dans la morphologie des microglies que les cellules sont activées (figure 1b). Un exemple de comptage des cellules…

Discussion

Microglie moduler CNS fonctionnement normal ainsi que les réponses inflammatoires à diverses pathologies. Fonctionnel remodelage synaptique par la microglie a été impliquée dans le maintien de l'homéostasie du cerveau normal ^15. Au cours de la cascade neurogène ils participent à la clairance des cellules progénitrices neurales du gyrus denté de l'hippocampe ^{4, 16.} Par conséquent, il est nécessaire de développer un système de culture dans lequel pour étudier la microglie néon…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidocaine, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-Cl
Gentamycin Sulfate	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish	Falcon	353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml			Dilute 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV