Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto
Summary
Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.
Abstract
A microglia residentes são as células de macrófagos, como do sistema nervoso central (SNC) e, como tal, têm um papel extremamente importante nos processos fisiológicos e patológicos, tais como a maturação do SNC em desenvolvimento, a esclerose múltipla, e lesão da medula espinal. Microglia podem ser ativados e recrutado para a ação por lesão neuronal ou estimulação, como dano axonal visto em MS ou trauma cerebral isquêmica resultante de acidente vascular cerebral. Estes membros imunocompetentes do SNC também são pensados para ter papel na plasticidade sináptica em condições não patológicas. Empregamos protocolos para microglia cultura de tecidos neonatais e adultos que são destinadas a maximizar o número de células viáveis, minimizando variáveis interferentes, tais como a presença de outros tipos de células do sistema nervoso central e os restos de cultura de células. Nós utilizamos grandes e facilmente discernível componentes do SNC (por exemplo, do córtex, os segmentos da medula espinal), o que torna todo o processo viável e reprodutível. O uso da célula adultas uma alternativa adequada para o uso de neonatal microglia do cérebro, como muitas patologias estudados afectam principalmente a medula espinal pós-natal. Esses sistemas de cultura são também úteis para testar directamente o efeito dos compostos que podem inibir ou estimular a activação da microglia. Uma vez que a activação da microglia, podem moldar os resultados da doença no SNC adulto, existe uma necessidade de sistemas in vitro em que a microglia neonatal e adulto podem ser cultivadas e estudadas.
Introduction
A microglia são as células imunitárias residentes do SNC, que mais se assemelham macrófagos periféricos em estrutura e função 1. Foi recentemente demonstrado que as células microgliais pós-natais derivar de progenitores mielóides primitivos e são gerados antes do oitavo dia da embriogênese erigir a noção anterior que progenitores hematopoiéticos pós-natais são a fonte da microglia no cérebro adulto 2. Eles desempenham um papel-chave em várias doenças neurológicas e pode responder rapidamente a uma infecção ou lesão, liberando citocinas pró-inflamatórias ou anti-inflamatória 3. Assim microglia abranger uma unidade autónoma no SNC, que podem ser manipuladas para afectar a progressão da doença. Desenvolvimento de métodos robustos e reprodutíveis para isolar e cultivar células microgliais recém-nascidos ou adultos é importante para estudos futuros.
Microglia é conhecido por ser jogadores críticos de um número de patologias cerebrais. Mais recentemente, o roles são emergente para as células em desenvolvimento e a função normal do cérebro, como microglia fagocitam excesso de células progenitoras neurais a partir de giro dentado do hipocampo de 1, 4. Microglia também pode modular várias condições neurológicas que afetam a medula espinhal, tais como MS, dor neuropática, e lesão medular 5-7. Microglia da medula espinal reagem de forma diferente em relação ao cérebro microglia em resposta a sinais de ativação 8, 9, provavelmente devido às diferenças no ambiente local. Assim, é importante estabelecer um adequado sistema in vitro para estudar a cultura e microglia espinal medula. Microglia Neonatal produzir significativamente mais do óxido nítrico citocina pró-inflamatória em comparação com células adultas após estimulação in vitro com o IFN-γ ou TNF-a, 10,11 destacando ainda mais a necessidade de utilizar células adultas para o estudo da microglia no contexto de certas doenças.
O protocolo que empregamos no laboratório de cuLTURE microglia neonatal é uma variação dos métodos recentes que utilizam a agitação de culturas mistas de glia, num esforço para remover a microglia da superfície do frasco de cultura de célula 12. Também descrevemos um método de cultura da microglia de ratinho adulto a medula espinal por meio do protocolo descrito pela primeira vez por Yip et ai 13. Este método proporciona uma maneira mais rápida de células adultas de cultura em comparação com outros protocolos disponíveis 14. A preparação resultante é de 70% a microglia, sendo a percentagem restante é constituída por astrócitos. Embora o grau de pureza da nossa cultura é menor em comparação com outros métodos publicados 13, este sistema de cultura é útil para explorar a microglia cultura em resposta a vários estímulos de activação, bem como para o estudo de doenças que afectam principalmente a medula espinal e no qual um forte resposta inflamatória é uma característica principal.
Todos os protocolos descritos foram aprovados pelo Stony Brook University IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microglia modular CNS funcionamento normal, bem como as respostas inflamatórias a diversas patologias. Funcional remodelação sináptica por microglia tem sido implicado na manutenção da homeostase do cérebro normal 15. Durante a cascata neurogênica participam na depuração de células progenitoras neurais do giro denteado do hipocampo 4, 16. Por conseguinte, é necessário desenvolver um sistema de cultura no qual a estudar microglia neonatal e adulto, que vai cobrir a vasta área do dese…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Tsirka para os seus conselhos e comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, um NSF-3MT IGERT e uma dissertação comunhão Turner a LT, e NSF-3MT IGERT de JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
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