<em> 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의> 준비
Summary
우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어 있습니다<em> 등</em>.
Abstract
장용 신경계의 기능적 위장 운동성을 제어 위장관의 길이를 실행하는 뉴런과 교세포의 광대 한 네트워크입니다. myenteric 신경 얼기의 신경 세포와 교세포의 혼합 인구의 분리 및 문화에 대한 절차를 설명합니다. 차 문화는 뉴런과 교세포 사이에 개발 연결을 7 일 이상 유지 될 수 있습니다. 첨부 myenteric 신경 얼기와 세로 근육의 스트립 마우스 회장 또는 결장의 기본 원형 근육에서 제거하고 소화 효소를 받게됩니다. 무균 조건에서 분리 된 신경 세포 및 교세포 인구는 펠릿 다음 원심 분리 내에 보존되어 coverslips를에 도금. 24-48 시간 내, 신경 돌기의 가지가 발생하고 신경이 팬의 연결을 마커로 식별 할 수 있습니다. 문화 이틀, 고립 된 뉴런 화재 활동 전위는 패치 클램프 연구에 의해 관찰했다. 또한, 장내 아교 세포는 지문을 확인해 될 수 있습니다GFAP 염색에 의해 IED. 가까운 동격의 뉴런과 교세포의 네트워크는 5 일 안에 형성 – 뛰기. 장내 뉴런은 개별적이어야하며 직접적 면역, 전기 생리학, 칼슘 이미징, 및 단일 세포 PCR 등의 방법을 사용하여 연구 할 수 있습니다. 또한이 절차는 유전자 변형 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 수행하는 간단하고 저렴합니다. 우리는 더 나은 정상과 질병 상태에있는 ENS의 기능을 발견 할 수 있도록 전반적으로,이 프로토콜은 쉽게 조작 방식 장용 신경계의 구성 요소를 노출합니다.
Introduction
장용 신경계 (ENS)는 신경 및 위장 (GI) 요로의 전체 길이를 실행하는 아교 세포의 광대 한 네트워크이다. ENS는 기능적으로 연동, 액체 흡수 / 분비, 자극의 감각 등 (검토를 위해 1 참조) 등의 소화의 모든 측면을 제어합니다. 그것은 척수에있는 이상 만 500 개 이상의 뉴런을 포함하고 뇌에서 발견 된 모든 신경 전달 물질의 클래스가 포함되어 있습니다. 또한, ENS는 중추 신경계 2에서 입력없이 반사적으로 작동 할 수 있다는 점에서 독특합니다. ENS의 이해는 정상적인 생리적 역할을 이해하지만, (의 히 르츠 프룽 질환), 인수 (샤 가스), 질병 상태 (당뇨병 위 마비)에 보조 약 선천성 할 수 있습니다 신경 병증의 다양한의 참여를 이해하기 위해뿐만 아니라 중요하다 유도 (아편 대장 증후군), 부상 (수술 후 장폐색) 1 때문이다. 또한, 장내 뉴런은 다시 할 수 있습니다바이러스 감염 (수두 대상 포진) 3 servoir. 때문에 뇌와 창자에있는 세로토닌의 높은 수준의 유사성, 중추 신경 계통의 결함을 치료 목적으로 약물은 종종 ENS 2 원치 않는 부작용이 있습니다. 그것은 알츠하이머 질환과 파킨슨 병 등 많은 신경 병증은 ENS 이러한 질병 4의 병인을 연구하는 접근 모델을 만들고, 중앙 신경에있는 자신의 모습 오래 전에 장내 신경 세포에서 유사한 세포 변화를 보여주는 것 또한 주목할 만하다. 따라서 ENS의 철저한 이해는 질병 상태를 이해하고 약물 부작용을 예방 / 예측 필요성이다.
ENS의 뉴런은 전통적으로 8월 5일에서 7일까지 또는 양식 뉴런 wholemount 준비를 사용하여 기니 돼지에서 공부하고 있습니다. 뉴런이 큰 동물에서 연구 될 수있는 용이함에도 불구하고,이 모델 등 많은 한계가있다유전자 변형 종자,이 종의 특정 시약의 부족, 그리고 이러한 주제를 주문과 주택과 관련된 높은 비용의 부족. 쥐 장용 신경계 모델의 개발 시스템, 세포 배양 기술과 함께 사용할 수있는 다른 설치 방법의 광대 한 배열, 그리고 기니 돼지 모델에 대한 유효성 검사를 제공하는 기능 중 다양한 노크의 고유 한 장점을 가지고 .
창자의 연동 작업을 주로 담당하는 외부 myenteric 신경 얼기 (경도와 원형 근육 사이)뿐만 아니라, 점막과 점막 플렉시 (: ENS는 위장관의 길이를 실행하는 세 가지 플렉시으로 구성되어 있습니다 주로 액체 흡수 / 분비 자극 1의 검출을 제어 점막, 각각) 아래에서 발견. 이 방법은 필링으로 세로 근육 / myenteric 신경 얼기 (LMMP) 준비의 격리로 시작GI 기관의 외부 근육 층 호텔 전문가. 이 극적으로 점막 층이 분리에 관여 할 때 발생하는 오염 문제에 아래로 잘라냅니다. 결과적으로,이 과정은 오히려 ENS의 분비 활동보다 운동성 신경 제어의 연구에 이상적입니다.
방법은 여기에 장내 뉴런과 교세포의 혼합 배양 결과를 발표했다. 뉴런의 적어도 두 가지 유형이 존재 이전의 전기 생리 및 면역 세포 관찰 9를 기준으로합니다. 아교 세포의 존재는 그들이 자신의 권리 연구하는 중요한 세포 유형뿐만 아니라이기 때문에 매우 유익하지만 그들은 장내 신경 (10)의 생존에 기여하고 신경 세포 표면에 11 고유 수용체의 발현을 유지한다. 또한, 장내 아교 세포의 결함은 '신경 gliopathies'12 만들어 낸 이상한 위장 운동성 질환 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서 ENS 문화는 여기에 제시된 연구조사 익은 여러 가지 세포 유형의 esults.
이 방법론의 장점은 격리, 저렴한 도구 요구 사항 및 경험 실험실 요원에 의해 기술을 마스터하는 짧은 시간의 용이성이다. 방법의 한계는 전반적으로 낮은 세포 높은 조직 볼륨에서 수율 및 점막 및 점막하 플렉시에서 ENS 뉴런의 배제를 이용하실 수 있습니다. 이 절차는 전기 생리학, 면역, 단일 셀 PCR 및 기타 방법론 전문 학자에 매우 유용 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
사용 동물
이 프로토콜은 스위스 웹스터 마우스에 최적화되어 있습니다. 그러나,이 방법은 쥐와 같은 다른 작은 포유 동물과 생쥐의 다른 변종에 쉽게 적응할 수있다. 우리는 성공적으로 C57 마우스 및 μ-아편 수용체 녹아웃으로 예비 고립감을 수행했습니다. 그러나 생쥐의 다른 변종 GI 기관의 형태 학적 변화로 인해 문제가 될 수있는 것도 가능하다. 또한, 최종 분리의 뉴런의 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
건강 그랜트 DA024009의 국립 연구소, DK046367 및 T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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