Un<em> In-vitro</em> Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto
Summary
Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia, immunoistochimica,<em> Ecc</em>.
Abstract
Il sistema nervoso enterico è una vasta rete di neuroni e glia funzionare la lunghezza del tratto gastrointestinale che controlla funzionalmente motilità gastrointestinale. Una procedura per l'isolamento e la coltura di una popolazione mista di neuroni e glia dal plesso mienterico è descritto. Le colture primarie possono essere mantenuti per più di 7 giorni con connessioni di sviluppo tra i neuroni e glia. La striscia di muscolo longitudinale con l'allegata mienterico plesso è spogliato dal muscolo circolare sottostante dell'ileo mouse o del colon e sottoposto a digestione enzimatica. In condizioni di sterilità, l'isolata popolazione neuronale e gliale sono conservati all'interno del seguente centrifugazione pellet e placcato su vetrini. Entro 24-48 ore, si verifica crescita dei neuriti e neuroni può essere identificato da marcatori pan-neuronale. Dopo due giorni di cultura, isolati neuroni potenziali d'azione di fuoco, come osservato da studi di patch clamp. Inoltre, glia enterica può anche essere indicanied di GFAP colorazione. Una rete di neuroni e glia in stretta apposizione forma entro 5 – 7 giorni. Neuroni enterici possono essere individualmente e direttamente studiati utilizzando metodi come l'immunoistochimica, elettrofisiologia, imaging del calcio, e la PCR singola cellula. Inoltre, questa procedura può essere eseguita in animali geneticamente modificati. Questa metodologia è semplice da eseguire e poco costoso. Nel complesso, questo protocollo espone i componenti del sistema nervoso enterico in modo facilmente manipolata in modo da poter meglio scoprire la funzionalità del ENS in stati normali e malattie.
Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è vasta rete di nervi e glia che corre per tutta la lunghezza del tratto gastrointestinale (GI). L'ENS controlla funzionalmente tutti gli aspetti della digestione, tra cui la peristalsi, l'assorbimento di liquidi / secrezione, sensazione di stimoli, ecc (per una rassegna vedi 1). Esso contiene oltre 500 milioni di neuroni, più che trovato nel midollo spinale, e contiene ogni classe neurotrasmettitore presente nel cervello. Inoltre, l'ENS è unico in quanto può funzionare senza riflesso input dal sistema nervoso centrale 2. Comprensione della ENS è cruciale, non solo per capire il suo normale ruolo fisiologico, ma per capire il suo coinvolgimento in una varietà di neuropatie che può essere congenito (malattia di Hirschsprung), acquisita (Chagas), secondaria a condizioni di malattia (gastroparesi diabetica), farmaco indotta (sindrome dell'intestino oppiacei), oppure a causa di un infortunio (ileo postoperatorio) 1. Inoltre, i neuroni enterici possono essere un reservoir per infezioni virali (varicella zoster) 3. A causa delle sue somiglianze con il cervello e gli alti livelli di serotonina nell'intestino, i farmaci volti a curare i difetti del sistema nervoso centrale spesso hanno effetti collaterali indesiderati sul ENS 2. Si osserva inoltre che molte neuropatie come il morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson mostrano cambiamenti cellulari simili nei neuroni enterici lunghi prima della loro comparsa in neuroni centrali, rendendo l'ENS un modello accessibile per studiare la patogenesi di queste malattie 4. Pertanto, una conoscenza approfondita della ENS è una necessità nel capire gli stati di malattia e la prevenzione / predire gli effetti collaterali farmacologici.
I neuroni del ENS sono stati tradizionalmente studiati nella cavia utilizzando preparati wholemount 5-7 o neuroni in coltura 8. Nonostante la facilità con cui i neuroni possono essere studiate in questo grande animale, questo modello ha molti limiti compresimancanza di ceppi geneticamente modificati, la mancanza di reagenti specifici per questa specie, e l'alto costo associato con l'ordinazione e che ospita questi soggetti. Lo sviluppo di un modello di sistema nervoso enterico murino ha il vantaggio unico di vari sistemi knock out, una vasta gamma di altre metodologie consolidate che possono essere utilizzati in combinazione con la tecnica di coltura cellulare, e la capacità di fornire una convalida per il modello cavia .
L'ENS è contenuto tre plessi che corrono la lunghezza del tratto gastrointestinale: l'esterno myenteric plesso (tra il muscolo longitudinale e circolare) che è principalmente responsabile per le azioni peristaltici dell'intestino, così come la mucosa e della sottomucosa plessi, ( trovato sotto e all'interno della mucosa, rispettivamente) che controlla in gran parte l'assorbimento di liquidi / secrezione e il rilevamento di uno stimolo. Questo metodo inizia con l'isolamento del plesso (LMMP) preparazione muscolare / myenteric longitudinale mediante pelaturalo strato muscolare esterno del tratto GI. Questo riduce drasticamente il problema della contaminazione che sorgono quando lo strato di mucosa è coinvolta nel isolamento. Come risultato, questo processo è ideale per lo studio del controllo della motilità neuronale piuttosto che azioni secretori della ENS.
Il metodo qui presentato risultati in una coltura mista dei neuroni enterici e glia. Almeno due diversi tipi di neuroni sono basate presenti sulle precedenti osservazioni elettrofisiologiche e immunocitochimica 9. La presenza di cellule gliali è estremamente vantaggiosa, in quanto non sono solo un tipo di cellula importante studiare nel loro diritto, ma contribuiscono alla sopravvivenza dei neuroni enterici 10 e di mantenere l'espressione del recettore nativo sulla superficie delle cellule neuronali 11. Inoltre, carenze di glia enterica possono portare ad anomalie della motilità gastrointestinale stati di malattia, coniato 12 'neuro-gliopathies'. Pertanto, la cultura ENS presentata qui risultati in diversi tipi di cellule che sono maturi per le indagini.
I vantaggi di questo metodo sono la facilità di isolamento, i requisiti di strumento poco costoso, e un breve periodo di tempo per padroneggiare la tecnica da parte di personale di laboratorio con esperienza. Limitazioni della metodologia includono bassa resa cella complessiva da elevati volumi di tessuto e l'esclusione dei neuroni dell'ENS di plexi mucosa e sottomucosa. Questa procedura sarà molto vantaggioso per gli studiosi specializzati in elettrofisiologia, immunoistochimica, PCR singola cellula, e altre metodologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Animali utilizzati
Questo protocollo è stato ottimizzato per Swiss Webster topi. Tuttavia, questo metodo è facilmente adattabile ad altri mammiferi di piccole dimensioni quali ratti e ad altri ceppi di topi. Abbiamo effettuato con successo isolamenti preliminari con i topi C57 e del recettore μ-oppioidi knock-out. Tuttavia, è anche possibile che altri ceppi di topi possono essere problematico a causa di variazioni morfologiche nel tratto GI. Inoltre, vi sono differenze note tra ceppi di top…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institute of Health di Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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