Dette papir beskriver procedurerne for taktil stimulation af rotteunger og efterfølgende Golgi-Cox farvning af neuronal morfologi. Taktil stimulation er en positiv oplevelse, der administreres i den perinatale periode ved at kæle hvalpe med en husstand støvekost. Golgi-cox farvning er en pålidelig procedure tillader visualisering af hele neuroner.
For at generere mere langsigtede ændringer i adfærd, skal erfaringer producere stabile ændringer i neuronal morfologi og synaptiske forbindelse. Taktil stimulation er en positiv tidlig oplevelse, der efterligner mødres slikke og grooming hos rotter. Udsættes rotteunger for denne positive oplevelse kan være afsluttet let og omkostningseffektivt ved hjælp af let tilgængelige materialer, såsom en husstand støvekost. Ved hjælp af en cross-kuld design, er ungerne enten strøg eller venstre uforstyrret, i 15 min, tre gange om dagen i hele den perinatale periode. For at måle de neuroplastiske ændringer i relation til denne positive tidlig oplevelse er Golgi-Cox farvning af hjernevæv udnyttet. På grund af det faktum, at Golgi-Cox imprægnering pletter et diskret antal af neuroner snarere end alle de celler, farvning af gnaverhjerner med Golgi-Cox løsning tillader visualisering af hele neuronale elementer, herunder cellen kroppen, dendritter axoner og dendritiske Torner. Pletningsproceduren is udført over flere dage, og kræver, at forskeren være meget opmærksom på detaljer. Men når farvning er afsluttet, hele hjernen er blevet imprægneret og kan bevares i det uendelige for den igangværende analyse. Derfor Golgi-Cox farvningen er en værdifuld ressource for at studere erfaring-afhængige plasticitet.
Selvom der er mange rapporteret og udnyttede teknikker til undersøgelse af negative tidlige erfaringer på hjernens modning, såsom perinatal stress 1,2, sensorisk deprivation 3 og narkotika toksicitet 4, der er meget få metoder, der anvendes til at undersøge virkningerne af positive erfaringer i denne periode. Bortset fra miljøberigelse, taktil stimulation er en af de få hjerne forbedre behandlinger med påviste effekter 5. Taktil stimulering er en metode til sensorisk stimulation til huden, der efterligner moderens rotte adfærd, slikke og grooming. Dens generel accept som en positiv manipulation opstår fra undersøgelser tyder på, at taktil stimulation forbedrede modning af for tidligt fødte spædbørn og nyfødte rotter 6. Desuden har forskning i Meaney laboratorium 7 viste, at højere niveauer af maternel slikke og grooming er knyttet til positive resultater i afkom. På grund these positive påvirkninger, taktil stimulation hurtigt udviklet sig til en afhjælpende strategi, der sigter på at reducere angst 8, forbedre udfald associeret med hjerneskade 9-11, og formildende medicin overfølsomhed 12. Som sådan, taktil stimulation er en værdifuld teknik til fremme af positive tidlige erfaringer, med en dokumenteret evne til at drastisk reorganisere neuronal morfologi og synaptiske tilslutning af hjernens udvikling.
For at undersøge og kvantificere ændringer i neuronal morfologi, er det nødvendigt at visualisere intakte neuroner. Golgi-Cox farvning procedure er en modifikation af Camillo Golgi teknik offentliggjort i slutningen af 1800, der giver diskret farvning af et lille antal af komplette neuroner 13. Selv om proceduren ser ud til at plette neuroner tilfældigt og reproducerbarhed er almindeligt nævnt som store fejl, den lille imprægnering sats tillader visualisering af hele neuronale element, herunder celle organer, dendritter, dendritiske Torner og axoner. Ligeledes har den nødvendige tid til at imprægnere en given hjerne med Golgi løsning også blevet nævnt som en undergang. Men i betragtning af, at når farvningen er færdig væv kan bevares på ubestemt tid, og tiden mellem perfusion af hjernen og visualisering af neuroner med et mikroskop kan være afsluttet på mindre end 21 dage, er ikke urimeligt tidsperioden. Hertil kommer, med mindre ændringer af protokollen, Golgi-Cox farvning kan bruges effektivt til at imprægnere hjerner af gnavere fra alle aldersgrupper. Da ændringer på det strukturelle niveau har været knyttet til vedvarende ændringer i adfærd og psykologisk funktion, Golgi-Cox farvning teknik giver forskerne et værdifuldt værktøj til at måle neuroplasticitet.
På grund af den åbenlyse plasticitet hjernens udvikling, er det vigtigt, at eksperimentelle procedurer, der involverer tidlige erfaringer grundigt revideret og der gøres forsøg på at kontrollere for alle mellemliggende variabler. Af denne grund er et kors kuld design ansat under den taktile stimulation procedure for at sikre, at hvalpe får lignende oplevelser i alle andre områder inden for udvikling. Derudover er det også vigtigt, at flere unger fra flere kuld udvalgt til analyse for at undgå muligheden for, at virkninger skyldes en skævhed i en enkelt pup eller strøelse.
Berøringsstimuleringen menes at efterligne naturligt forekommende moderens adfærd, slikke og grooming, hvilket menes at være gavnlig for afkom udvikling. Selvom tidligere forskning har understreget den første leveuge (P0-P7) for at være en kritisk periode for at slikke og grooming 16, selve omfanget af forandringer identificeres 18 dages tactile stimulation kan betyde, at selv om følsomme tider eksisterer, længere eksponering er overlegen. Det er også vigtigt at bemærke, at hvalpe, der modtager taktil stimulation i denne eksperimentelle paradigme også opleve slikke og grooming af deres mødre, dermed taktil stimulation er i tillæg til normal stimulation administreres af moderen. Endelig må man også være bevidste om regionsafhængige ændringer. Selv taktil stimulation under udvikling øget dendritiske kompleksitet i den præfrontale cortex, er dette ikke garantere, at strukturelle ændringer af denne art vil være tydelig i alle områder af hjernen. Det er muligt, at neuronal morfologi i andre områder af hjernen, såsom parietalcortex ville reagere på en markant anderledes måde til den samme oplevelse. , Fordi den taktile stimulation procedure nemt administreres og udgør ingen risiko for afkommet eller dæmninger Men det har potentiale til at fungere som et værdifuldt redskab for mange videnskabelige undersøgelser, der tager sigte på at forbedre udviklingal resultater.
Med hensyn til Golgi-Cox farvning af hjernevæv, de kritiske trin for succesfuld visualisering af neuronale celler er som følger: 1) der skal være tilstrækkelig perfusion af hjernen med saltopløsning. Ukorrekt eller utilstrækkelig perfusion af hjernen væv resulterer i blodkarrenes artefakter, der gør det vanskeligt at faktisk visualisere neuronale celler gennem labyrinten af blodkar, mens komplicerer også evnen til at fotografere farvede neuroner. 2) perfuseret hjerner skal opbevares i Golgi-Cox-opløsning og sucroseopløsning i mørke. Lagring af hjernevæv i mørke reducerer baggrundsfarvning af vævet igen øger chancen for succes visualisere kvalitet neuronale celler. 3) Hjernevæv lagres i rørsukkeropløsning efter opbevaring i Golgi-Cox løsning 14 dage. Når vævet er nedsænket i 30% saccharose løsning for 2-5 dage, hjerner er mere smidigt som forhindrer rystende og rive af sektioner, nårskæring. Det er vigtigt at forhindre hjernevæv forbliver i rørsukkeropløsningen for øgede tidsperioder (medmindre rørsukkeropløsningen kontinuerligt erstattet med frisk opløsning), fordi langvarig opbevaring i sucrose reducerer farvning kvalitet. 4) Endelig, når dias er blevet farvet og dække smuttede, de skal have tilstrækkelig tid til at tørre, før visualisering med et mikroskop. Hvis objektglassene ikke er tilladt i tilstrækkelig lufttørre, kan vævet mørkere, reducere vellykket visualisering af kortikale neuroner.
Stabile ændringer i psykisk funktion og adfærdsmæssige reaktioner, der opstår som reaktion på oplevelser menes at blive lettet ved reorganisering af neuronal morfologi og synaptisk forbindelse 17. Da disse strukturændringer giver en målelig ressource for erfaring-afhængige plasticitet, er det vigtigt at anvende en pålidelig farvningsprocedure. Denne vibratome baserede Golgi-Cox farvning procedure giver pålidelig pleting af fine grene og dendritiske pigge, der måske ikke er tydeligt med andre protokoller, såsom celloidin-embedding. Særpræg Golgi-Cox procedure stammer fra dens evne til at kun plette en lille brøkdel af neuronale elementer (1-10%), der tillader sporing af enkelte neuroner til lange afstande. Trods det faktum, at kun en lille brøkdel af neuroner er imprægneret med den plet, celler, der er synliggjort, bevare alle funktioner, herunder celle krop, dendritter, dendritiske Torner og axoner. Desuden, når farvningsproceduren udføres korrekt, de farvede celler fremstå klart og tydeligt mod en gennemsigtig baggrund, fordi andre kortikale strukturer forbliver ufarvede og gennemsigtig. På grund af den erkendelse, at vedvarende forandringer i udadgående funktion skal være relateret til den plasticitet af nervesystemet, dvs evnen til neuroner til at ændre deres struktur og tilslutningsmuligheder, Golgi-Cox farvning procedure giver forskere med enpålidelig teknik til at visualisere og kvantificere denne plasticitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af NSERC tilskud til BK og RG. Forfatterne vil også gerne takke Kehe Xie og Russell Hosain for deres Golgi-Cox farvning ekspertise.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |