מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.
כדי ליצור שינויים ארוך טווח בהתנהגות, חוויות חייבים להיות הפקת שינויים יציבים במורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה ראשונית חיובית שמחק אימהית ללקק וטיפוח בחולדה. חשיפת גורי חולדה לחוויה חיובית זה יכול להסתיים בקלות וביעילות על ידי שימוש בחומרים נגישים מאוד כגון מטלית משק בית. באמצעות עיצוב המלטה צולבת, גורים הם ליטפו אחד או שמאלה באין מפריע, במשך 15 דקות, שלוש פעמים ביום לאורך כל התקופה סביב הלידה. כדי למדוד את שינויי neuroplastic הקשורים לניסיון המוקדם החיובי הזה, מכתים Golgi-קוקס של רקמת המוח מנוצל. בשל העובדה שהספגת Golgi-קוקס מכתימה מספר בדיד של נוירונים ולא כל התאים, מכתים של המוח המכרסם עם פתרון Golgi-קוקס מאפשר ההדמיה של אלמנטים עצביים כולה, ובכלל זה גוף התא, דנדריטים, אקסונים, ו קוצים הדנדריטים. I ההליך מכתיםים שבוצע על פני כמה ימים ודורש שהחוקר לשים לב לפרטים. עם זאת, ברגע שמכתים הושלם, כולו המוח כבר ספוג ויכול להישמר לזמן בלתי מוגבל לניתוח מתמשך. לכן, מכתים Golgi-קוקס הוא משאב יקר ערך לחקר פלסטיות חוויה תלויה.
אמנם יש טכניקות רבות דיווחו ומנוצלות לבחינת חוויות שליליות בשלב מוקדם הבשלת המוח, כגון מתח סביב הלידה 1,2, חסך חושי 3, ורעילויות תרופת 4, יש מעט מאוד מתודולוגיות המועסקות כדי לבחון את ההשפעות של חוויות חיוביות ב פרק זמן זה. מלבד העשרה סביבתית, גירוי חוש המישוש הוא אחד מכמה מוח שיפור טיפולים עם אפקטים הפגינו 5. גירוי חוש המישוש הוא שיטה של גירוי חושי לעור המחקה את התנהגות החולדה האימהית, מלקק וטיפוח. הקבלה הכללית שלה כמניפולציה חיובית העולה ממחקרים המראים כי גירוי חוש המישוש השתפר הבשלה של פגים וחולדות שזה עתה נולדו 6. בנוסף, מחקר במעבדה מייני 7 הוכיח כי רמות גבוהות יותר של ליקוק וטיפוח אימהיים צמודות לתוצאות חיוביות בצאצאים. בשל tהשפעות חיוביות hese, גירוי חוש המישוש התפתחו במהירות לתוך אסטרטגיה מתקנת שמטרתה הפחתת חרדה 8, שיפור תוצאות הקשורים לפגיעה מוחית 9-11, והפחתת רגישות לסמים 12. ככזה, גירוי חוש המישוש הוא טכניקה רבת ערך לקידום חוויות מוקדמות חיוביות, עם יכולת מוכחת לארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית של המוח המתפתח באופן דרמטי.
על מנת לבחון ולכמת את השינויים במורפולוגיה עצבית, יש צורך לדמיין נוירונים בשלמותה. ההליך מכתים Golgi-קוקס הוא שינוי של הטכניקה של קמילו גולג'י שפורסמה בסוף 1800s המספקת צביעה של מספר קטן של תאי עצב מלאים 13 בדידה. למרות ההליך מופיע להכתים נוירונים באקראי והשחזור מצוטט בכינויו פגם עיקרי, ההדמיה היתרי שיעור הספגה הקטנה של המרכיב העצבי כולה, כוללים לסה"נגופי ll, דנדריטים, קוצים הדנדריטים, ואקסונים. באופן דומה, את הזמן הנדרש כדי להספיג מוח נתון עם פתרון Golgi גם צוטט כנפילה. עם זאת, בהתחשב בכך שפעם אחת הצביעה היא רקמה שלמה יכולה להישמר ללא הגבלת זמן, ואת הזמן בין טפטוף של המוח וההדמיה של הנוירונים במיקרוסקופ ניתן להשלים בתוך פחות מ21 ימים, תקופת הזמן היא לא בלתי סבירה. בנוסף, עם שינויים קלים בפרוטוקול, מכתים Golgi-קוקס ניתן להשתמש ביעילות כדי להספיג מוחם של מכרסמים מכל הגילאים. כמו שינויים ברמה המבנית נמצאו קשורים לשינויים מתמשכים לתפקוד ההתנהגותי ופסיכולוגי, את טכניקת צביעת Golgi-קוקס מספקת חוקרים עם כלי רב ערך כדי למדוד neuroplasticity.
בשל הפלסטיות הגלויה של המוח המתפתח, חשוב שהפרוצדורות הכרוכות בחוויות מוקדמות נבדקות ביסודיות ונעשים ניסיונות לשלוט בכל המשתנים מתערבים. מסיבה זו, עיצוב המלטת צלב מועסק במהלך הליך גירוי חוש המישוש כדי להבטיח שגורים מקבלים חוויות דומות בכל התחומים האחרים של התפתחות. בנוסף, חשוב גם שגורים מרובים מהמלטות מרובות נבחרו לניתוח, כדי למנוע את האפשרות שתופעות נובעות מהטיה בגור או המלטה אחת.
הוא האמין גירוי חוש המישוש כדי לחקות את ההתנהגות האימהית הטבעי, מלקק וטיפוח, אשר נחשב כמועיל להתפתחות צאצאים. למרות שהמחקר קודם הדגיש בשבוע הראשון לחייהם (P0-P7) להיות תקופה קריטית לליקוק וטיפוח 16, הגודל העצום של שינוי שזוהה הבא 18 ימים של taגירוי ctile עשוי לרמוז כי למרות שפעמים רגישות קיימות, חשיפה ארוכה יותר היא מעולה. כמו כן, חשוב לציין כי גורים מקבלים גירוי חוש המישוש בפרדיגמה ניסויית זו גם לחוות ללקק וטיפוח על ידי האמהות שלהם, ולכן גירוי חוש המישוש הוא בנוסף לגירוי נורמלי מנוהל על ידי האמא. לבסוף, צריך גם להיות מודע לשינויים באזור תלוי. למרות שגירוי חוש המישוש במהלך התפתחות גידול במורכבות דנדריטים בקליפת מוח הקדם חזיתית, זה לא מבטיח ששינויים מבניים מסוג זה יהיו ברורים בכל אזורי המוח. יתכן שהמורפולוגיה עצבית באזורי מוח אחרים, כגון קליפת המוח הקודקודית, תגיב באופן שונה לחלוטין לאותה החוויה. עם זאת, מאחר שהליך גירוי חוש המישוש מנוהל בקלות ואינו מהווה סיכון לצאצאים או סכרים, יש לו הפוטנציאל לשמש ככלי רב ערך למחקרים רבים שנועדו לשפר את הפיתוחאל תוצאות.
עם כל כבוד לצביעת Golgi-קוקס של רקמת המוח, הצעדים הקריטיים להדמיה מוצלחת של תאים עצביים הם כדלקמן: 1) חייבת להיות זלוף נאות של המוח עם תמיסת מלח. זלוף לא נכון או לא מספיק של תוצאות רקמת המוח בחפצי כלי דם זה עושים את זה קשה לדמיין בעצם תאים עצביים במבוך של כלי דם, בעוד שמסבך את היכולת לצלם נוירונים צבעוניים גם. 2) מוח perfused צריך להיות מאוחסן בפתרון Golgi-קוקס ותמיסת סוכרוז בחושך. אחסון רקמת המוח בחושך מפחית את מכתים הרקע של הרקמה, שוב מגדיל את הסיכוי להמחשה בהצלחה תאים עצביים איכות. 3) רקמת המוח מאוחסנת בתמיסת סוכרוז הבאה אחסון 14 היום בפתרון Golgi-קוקס. כאשר הרקמה היא שקועה בפתרון סוכרוז 30% ל2-5 ימים, המוח הוא גמישים יותר המונע מתנפץ וקריעה של חלקים כאשרחיתוך. זה חשוב כדי למנוע מרקמת המוח שנותר בתמיסת סוכרוז לפרקי זמן מוגבר (אלא אם כן פתרון סוכרוז מוחלף ברציפות עם פתרון טרי), כי אחסון ממושך בסוכרוז מפחית את האיכות מכתים. 4) לבסוף, לאחר שקופיות כבר מוכתמות וכיסוי החליק, הם צריכים לתת מספיק זמן לייבוש לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ. אם שקופיות אינן רשאים ישודרו כראוי יבש, הרקמה עלולה להכהות, הפחתת הדמיה מוצלחת של תאי עצב בקליפת המוח.
שינויים יציבים בתפקוד פסיכולוגי ותגובות התנהגותיות המתרחשים בתגובה לחוויות הם האמינו להיות בהנחייתם של ארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית 17. שינויים המבניים אלה מספקים משאבים למדידה לפלסטיות חוויה תלויה, השימוש בהליך מכתים אמין הוא חשוב. הליך מכתים Golgi-קוקס מבוסס vibratome זה מספק כתם אמיןing של ענפים דקים וקוצים הדנדריטים שלא יכול להיות ברור עם פרוטוקולים אחרים כגון celloidin-הטבעה. ייחודו של הליך Golgi-קוקס נובע מיכולתה כדי להכתים חלק קטן של אלמנטים עצביים (1-10%), המאפשר איתור של נוירונים בודדים למרחקים ארוכים בלבד. על אף העובדה שרק חלק קטן של הנוירונים ספוגים עם הכתם, תאים הניתנים לעין, לשמור על כל התכונות, כולל גוף תא, דנדריטים, קוצים הדנדריטים ואקסונים. יתר על כן, כאשר ההליך מכתים מתבצע בצורה נכונה, התאים המוכתמים להתבלט באופן ברור ומובהק על רקע שקוף, משום שמבנים בקליפת המוח אחרים יישארו ללא רבב ושקוף. בשל ההבנה ששינויים מתמשכים בתפקוד חיצוני חייבים להיות קשורים לפלסטיות של מערכת העצבים, כלומר היכולת של תאי עצב כדי לשנות את המבנה והקישוריות שלהם, ההליך מכתים Golgi-קוקס מספק לחוקריםטכניקה אמינה לחזות ולכמת פלסטיות זה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענקי NSERC לBK וRG. המחברים גם רוצים להודות לKehe שיה וראסל חוסיין למומחיות מכתים Golgi-קוקס.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |