Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Summary

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Abstract

Il midollo spinale zebrafish è un modello di indagine efficace per la ricerca del sistema nervoso per diverse ragioni. In primo luogo, gli approcci atterramento genetica, transgenici e geni possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. In secondo luogo, i grandi innesti di embrioni evolutivamente sincronizzati prevedono grandi misure sperimentali del campione. In terzo luogo, la chiarezza ottica dell'embrione zebrafish permette ai ricercatori di visualizzare progenitore, gliali e popolazioni neuronali. Anche se embrioni di zebrafish sono trasparenti, spessore del provino può impedire efficace visualizzazione microscopica. Una ragione di ciò è lo sviluppo tandem del midollo spinale e tessuto somite sovrastante. Un altro motivo è la grande palla tuorlo, che è ancora presente durante i periodi di precoce neurogenesi. In questo articolo, dimostriamo microdissezione e la rimozione del tuorlo di embrioni fisse, che permette la visualizzazione microscopica preservando il tessuto circostante somite. Noi also dimostrare montaggio semipermanente di embrioni di zebrafish. Questo permette l'osservazione dei neurodevelopment negli assi dorso-ventrale e antero-posteriore, in quanto conserva la tridimensionalità del tessuto.

Introduction

Visualizzazione del midollo spinale in zebrafish è inibita da una serie di fattori. Grazie allo spessore dei somiti sovrastanti e la posizione interna del midollo spinale, una distanza considerevolmente lungo lavoro è necessaria per alta risoluzione cellulare. La palla tuorlo (che è ancora presente durante le prime fasi di neurogenesi) aumenta ulteriormente la distanza di lavoro richiesto, ed è facilmente danneggiata da pressione da un vetrino. Inoltre, i detriti dal tuorlo danneggiato vieta chiara visualizzazione dei tessuti. Sebbene sezioni trasversali nelle (DV) asse dorso-ventrale sono possibili, non facilmente consentono la visualizzazione simultanea in antero-posteriore (AP) asse ^1.

Per superare questi ostacoli, embrioni vengono sezionati e montate su vetrini. Questa procedura offre diversi vantaggi. In primo luogo, embrioni di zebrafish facilmente si trovano con la parte laterale rivolta verso l'alto, che facilita la visualizzazione asse AP. In secondo luogo, la rimozione del BAL tuorlol diminuisce la distanza di lavoro desiderata, e limita detriti. In terzo luogo, la procedura di montaggio consente sia a fluorescenza e microscopia in campo chiaro. Quarto, embrioni montati sono stabili per mesi a 4 ° C, consentendo la visualizzazione campione prolungato. Infine, la progressione di sviluppo si verifica in quanto segmenti anteriori sono più maturo di segmenti posteriori. Al fine di garantire che allestite hemisegments spinali abbinati sono confrontati tra embrioni, sovrastante tessuto somite viene utilizzato come guida. Ad esempio, il decimo somite più posteriore sovrappone il hemisegment midollo decimo, che è evolutivamente equivalente in embrioni fase corrispondenza. Questa procedura di montaggio degli embrioni intatti permette una facile identificazione dei somiti.

Usiamo la genetica e le tecnologie gene knock-basso per studiare i meccanismi di orientamento degli assoni in via di sviluppo midollo spinale. In particolare, abbiamo determinato che robo2, ROBO3 e DCC sono necessari per commissurale primaria Asceending (COPA) assone pathfinding. Utilizzando la procedura di montaggio descritta qui, siamo stati in grado di esaminare la crescita ventrale, attraversamento linea mediana, larghezza commissure, dorsale ed anteriore ^2,3 crescita. Questa procedura di montaggio può essere applicata anche a DV o AP patterning del midollo spinale. Abbiamo utilizzato questa procedura per determinare ruoli disparati valle effettori Wnt in DV patterning del midollo spinale. Usando questo montaggio, siamo riusciti a ottenere la risoluzione di marcatori DV a livello di singola cellula, e determinare spostamenti patterning minute a seguito della ricezione del segnale alterato Wnt ^4,5. Questa procedura di montaggio consente anche di calcolo dell'indice mitotico attraverso anti-phosphohistone 3 o etichettatura BrdU (progenitore proliferazione) differenziamento ^5.

Protocol

1. Embrioni di montaggio (al completamento della tecnica di visualizzazione selezionato, quali immunocitochimica, ibridazione in situ, ecc) Posizionare embrioni in un piatto 35 millimetri Petri riempita con tampone di scelta (Figura 1A). La scelta del buffer è basata sulla procedura di etichettatura. Tipicamente buffer basati PBS sono adatti. Sotto un microscopio da dissezione, e usando pinze, proteggere la testa con un paio di pinze mentre si tira il tuorlo via con l'altra coppia (Figura 1B). In alternativa, utilizzare un perno insetto in un supporto del perno insetto per tirare delicatamente il tuorlo. Utilizzando il poker embrione (lenza (diametro 0,41 millimetri) incollato, o un tubo capillare o una pipetta Pasteur) spostare gli embrioni ad una parte della piastra di Petri che non ha un sacco di tuorlo detriti (Figure 1C-D). Usando una pipetta Pasteur di vetro, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile, e gdipendentemente loro pipetta su un vetrino (Figura 1E). Favorire la delicatezza di distanza il liquido in eccesso con un laboratorio wipe. Evitare il contatto con gli embrioni. Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio agli embrioni. Per le etichette fluorescenti, usare un reagente antifade di scelta. Per segnali colorimetrici, 70% glicerolo può essere utilizzato come mezzo di montaggio. Utilizzando il poker embrione, orientare gli embrioni sui loro lati a righe (Figura 1F). Aggiungere un "tocco" di vaselina o grasso alto vuoto ad ogni angolo di un coprioggetto (Figura 1G). Questo previene i danni di embrione da eccessiva compressione. Posizionare coprioggetto (lato vaselina basso) sulla parte superiore di embrioni (Figura 1H). Battere delicatamente il vetrino in ogni angolo fino a quando il mezzo di montaggio (70% glicerolo o reagente di montaggio anti-fade) tocca il vetrino (Figura 1H). Se necessario, aggiungere ulteriori supporti di montaggio pipettando proprio accanto alla coverslip, usando una pipetta nell'intervallo 20-200 ml. Sarà dello stoppino sotto. Utilizzando un laboratorio pulire, pulire completamente intorno al vetrino. Essere certi di non applicare pressione sul vetrino, in quanto questo potrebbe danneggiare gli embrioni. Questa area deve essere asciutta e non hanno alcun vaselina o supporti di montaggio su di esso. Utilizzare smalto per sigillare intorno al bordo del vetrino (Figura 1I).

Representative Results

Quando chiarire i meccanismi che sottendono vari eventi sviluppo come patterning cellulare, la differenziazione, e guida degli assoni, è importante essere in grado di visualizzare le cellule nel contesto della loro tessuto. Difetti patterning dorsoventral tipicamente presenti come uno spostamento ventrale o dorsale nel dominio espressione dei fattori di trascrizione nella pax, NKX, o famiglie dbx 4. A volte, i cambiamenti possono essere sottili, comprendente solo pochi diametri cellulari 4. Analisi della sezione trasversale consente questo tipo di analisi. Tuttavia, i reagenti con segnali più deboli, o sezioni trasversali che non sono perpendicolari all'asse AP possono limitare interpretazione. Inoltre, l'analisi in sezione trasversale non facilmente prendere in considerazione se le modifiche persistono nell'asse AP, e si basa sulla disponibilità di un criostato. Questa limitazione viene aggirata da una vista laterale del midollo spinale. Come si vede nella Figura 2B, nkx6.1 mRNA è distributed in circa la metà ventrale del midollo spinale a 24 ore post-fecondazione (HPF), all'interno del dominio progenitore. Cellule progenitrici sono distinguibili da cellule post mitotiche dovuti alla presenza della piastra, che si trova nella parte mediale del midollo spinale. Visto con ottica DIC, le singole celle sono chiaramente distinguibili, e un confine definito tra esprimere e nonexpressing cellule è evidente. Uscita dal ciclo delle cellule progenitrici è accompagnata da cambiamenti nell'espressione genica. Ad esempio, tutti i neuroni post-mitotici esprimono Huc / D che è rilevabile con immunocitochimica 1,5. sonde mRNA per isolotto, gata, e le famiglie VSX etichettare specifici neuroni post-mitotici di posizione coerente e il numero all'interno di ogni hemisegment del midollo spinale 6. Inoltre, recettori orientamento assone come quelli della famiglia robo sono espressi in popolazioni ristrette di neuroni post-mitotici (Figura 2C) <sup> 2,7,8. Montaggio laterale di embrioni permette conteggi accurati di neuroni post-mitotici. Allo stesso modo, progenitori che continuano a dividere possono essere quantificati con anti-fosfo-istone 3 immunocitochimica così come l'etichettatura BrdU. Inoltre, la morte cellulare può essere valutata con etichettatura TUNEL 4-6. Al 24 hpf, gli assoni dei neuroni seguenti postmitotici possono essere visualizzati con vari metodi, e sono distinguibili a livello di singola cellula: dorsale laterale Crescente (dola), commissurali primaria Crescente (COPA), commissurali secondaria Crescente (COSA), ventrale longitudinale Descending (Veld), Kolmer-Agdur (KA), commissurali biforcano / longitudinali (COB / L), circonferenza Ascendente (CIA), circonferenziale Discendente (CID), e unipolare commissurali Discendente (UCoD), ROHON-Barba (RB), motoneuroni ( M) 9. Gli assoni si estendono da questi neuroni nella dorsale, ventrale, anteriore, posteriore e le indicazioni. Essi ramo, attraversano la linea mediana, e uscire sia la dorsalee ventrale del midollo spinale. Quando accoppiato con microscopio confocale a scansione laser, questi comportamenti cellulari vari sono evidenti in embrioni montati lateralmente, mediante immunocitochimica e proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP 2. Nella Figura 2D, ZNP-1 immunocitochimica è stato usato per etichettare motoneuroni in via di sviluppo. Motoneuroni escono dal midollo spinale ventrale per innervare la muscolatura circostante in via di sviluppo. Figura 1. Dissezione e laterale montare di embrioni di zebrafish. (A) previa trasformazione per immunofluorescenza, ibridazione in situ, ecc, gli embrioni sono posti in un piatto 35 millimetri Petri riempite con PBT (PBS con 0,5% Triton X-100) o PTW (PBS con 0.1% Tween-20). Il tuorlosfera (YB) è evidente. (B) Il tuorlo viene rimosso dal fissaggio della testa dell'embrione successiva accurata dissezione. (C) Un poker embrione (lenza incollato ad una pipetta Pasteur) è usato per embrioni distinti e detriti tuorlo (D). Puliti gli embrioni sono pipettati su un vetrino da microscopio (E) e allineate (F). (G) Vaselina viene applicata agli angoli del coprioggetto. (H) Il vetrino viene posizionato delicatamente sulla sommità degli embrioni mezzo di montaggio. (I) Smalto viene utilizzato per sigillare i bordi del coprioggetto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . < strong> Figura 2. Analisi del pattern di espressione genica e assone pathfinding in laterale montato embrioni di zebrafish. (A) Disegno di un embrione di pesce zebra a 24 HPF. In BD, circa quattro hemisegments sopra l'estensione del sacco vitellino vengono visualizzate (zona in scatola). (B) nkx6.1 è espressa nel midollo spinale ventrale, compresa la piastra (FP). (C) ROBO3 è espresso nei neuroni post-mitotici (PMN). La zona pavimento piatto e progenitore non è evidente in questo piano focale più laterale. In B, C, il midollo spinale è delimitata da una staffa sul lato sinistro dell'immagine. (D) microscopio confocale è stato utilizzato per l'immagine ZNP-1 immunofluorescenza, che le etichette assoni motori che escono dal midollo spinale ventrale. In tutte le immagini, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Una lunga distanza di lavoro 40X, immersione in acqua (NA 0,8) lente è stata usata (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Discussion

Montaggio laterale di zebrafish embrioni aiuti visualizzazione fisso di sviluppo del midollo spinale. Attraverso la rimozione del pallone tuorlo, la distanza di lavoro richiesto per eccezionali immagini microscopiche è ridotta. I nostri risultati rappresentativi sono stati limitati alla fase 24 HPF, tuttavia, questa tecnica può essere usato già 18 HPF, sebbene embrioni anteriori sono più difficili da sezionare a causa delle dimensioni dell'embrione e la fragilità del tessuto. Questa tecnica è applicabile agli embrioni di età superiore a 24 HPF anche. Aiutato dalla chiarezza ottica della zebrafish embrionale, la capacità di eseguire esami genetici avanti, genetica inversa, e gli approcci transgenici, diversi processi di sviluppo possano essere istruite. Questo include gli indici mitotici di progenitori neuronali con marcatori come BrdU e anti-fosfo-istone marzo ^4-6 e patterning attraverso l'espressione di marcatori progenitrici neuronali e gliali nella pax, NKX, dbx, e olig families ^1,4-6. Reattivi che riportano la determinazione gliali e neuroni (come proteina gliale fibrillare acida (GFAP) e Huc / D) ^1,4,5,10 può essere utilizzato. Differenziazione sottotipo neuronale può essere analizzata attraverso l'espressione di isolotto, VSX, engrailed, ei geni gata ^1,4-6. E, infine, l'analisi di guida degli assoni è possibile attraverso anticorpi come tubulina anti-acetilata, 3A10, e ZNP-1 ^2,11,12. Anche se altri sistemi modello vertebrato (mouse e pulcino) vengono utilizzati per studiare lo sviluppo del midollo spinale, solo il permesso di zebrafish visualizzazione simultanea di tutti gli assi di sviluppo nell'embrione intatto.

La limitazione evidente di questo approccio è che gli embrioni sono fissi, che esclude l'imaging dal vivo. Infatti, la rimozione di (o danni) i risultati tuorlo in rapida morte embrionale, quindi non è possibile ridurre la distanza di lavoro in embrioni vivi con questa tecnica. Tuttavia, alto ingrandimento co spinalerd immagini in embrioni vivi è possibile. Per conservare il tuorlo durante l'imaging in tempo reale, gli embrioni possono essere posizionati in diapositive depressione, che forniscono uno spazio più grande tra il campione e il coprioggetto. In alternativa, più 22 mm x 22 millimetri coprioggetto possono essere incollati su entrambi diapositiva di un 3 x 1 in preparati al microscopio. I coprioggetti servono come "ponte" per il coprioggetto sovrastante. Se gli embrioni sono più vecchi di 18 HPF, tricaine viene utilizzato per anestetizzare gli embrioni per impedire il movimento. Mentre è necessaria una distanza di lavoro di 0,288 millimetri per embrioni deyolked a 24 HPF, quando si lavora con embrioni vivi incorporati in agarosio, con tuorli intatti, una lente microscopica con una distanza di lavoro di 3,3 mm sono sufficienti. In alternativa, le culture espianto derivate da embrioni deyolked possono essere visualizzati con un coagulo di plasma tecnica di immobilizzazione ^13. Varie popolazioni di cellule possono essere osservati attraverso l'uso di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate come GFP, mCherry, o il photoconcolorante convertibili Kaede (per citarne alcuni). Inoltre, le cellule fluorescente all'interno embrioni chimerici possono essere visualizzati anche con questo approccio ^14.

Una tecnica di montaggio coerente e stabile per mesi, è uno strumento fondamentale per i biologi dello sviluppo e cellulari. Questa tecnica semplice è riproducibile, che permette un facile confronto tra le diverse prove sperimentali. Inoltre, l'allineamento di embrioni in righe permette facilmente l'identificazione di embrioni specifici per una successiva analisi.

Materials

Petri dishes 35mm X 10mm	VWR	25373-041
Dumont Forceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Cover glass	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	Any grocery store
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12

Name of Equipment	Company	Catalog number
Olympus Stereo microscope	Olympus	SZ61