Develop processer såsom proliferation, mönstring, differentiering och axon vägledning kan lätt modelleras i zebrafisk ryggmärgen. I den här artikeln beskriver vi en monteringsförfarande för zebrafisk embryon, vilket optimerar visualisering av dessa händelser.
Den zebrafisk ryggmärgen är en effektiv utredningsmodell för nervsystemet forskning av flera skäl. Först, kan genetiska, transgena och gen knockdown metoder användas för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom nervsystemets utveckling. För det andra, stora kopplingar av utvecklingsmässigt synkroniserade embryon ger stora experimentella provstorlekar. För det tredje, den optiska klarheten hos zebrafisk embryot tillåter forskare att visualisera stamfader, gliaceller och neuronala populationer. Även om zebrafisk embryon är transparenta, kan provet tjocklek hämma en effektiv mikroskopisk visualisering. En orsak till detta är den tandem utvecklingen av ryggmärgen och överliggande somit vävnad. En annan orsak är den stora gule boll, som fortfarande är närvarande under perioder av tidig neurogenes. I den här artikeln visar vi microdissection och avlägsnande av äggula i fasta embryon, vilket gör att mikroskopiska visualisering samtidigt som omgivande somit vävnad. Vi also visa semipermanent montering av zebrafisk embryon. Detta medger observation av neurodevelopment i dorso-ventrala och främre-bakre axlar, eftersom den bevarar tre-dimensionalitet av vävnaden.
Visualisering av ryggmärgen i zebrafish inhiberas av ett antal faktorer. På grund av att tjockleken hos de överliggande somiter och den interna platsen för ryggmärg, är en avsevärt lång arbetsavstånd som erfordras för hög cellulär upplösning. Den gula bollen (som fortfarande är närvarande under tidiga stadier av neurogenes) ökar ytterligare arbetsavstånd som krävs, och skadas lätt av trycket från ett täckglas. Dessutom skräp från skadade äggula förbjuder tydlig visualisering av vävnader. Även tvärsektioner i Dorso-ventrala (DV) axel är möjliga, behöver de inte enkelt tillåter samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) axel 1.
För att övervinna dessa hinder är embryon dissekerades och monterades på objektglas. Detta förfarande ger flera fördelar. Först, zebrafisk embryon ligga lätt med den laterala sidan uppåt, vilket underlättar AP axel visualisering. För det andra, avlägsnande av äggula ball minskar den nödvändiga arbetsavstånd, och begränsar skräp. För det tredje ger detta monteringsförfarande för både lysrör och bright mikroskopi. För det fjärde, monterade embryon är stabila för månader vid 4 ° C, vilket gör långvarig exemplar visualisering. Slutligen sker utvecklingen av utvecklingen i att främre segment är mer mogen än bakre segment. För att säkerställa att iscensatta matchade ryggrads hemisegments jämförs mellan embryon är liggande somit vävnad användas som vägledning. Till exempel, ligger över den tionde mest bakre somit tionde spinal hemisegment, vilket är utvecklingsmässigt motsvarande i scenmatchade embryon. Detta montaget av intakta embryon gör det lätt att identifiera somites.
Vi använder genetik och gen knock-down teknik för att studera mekanismerna för Axon vägledning i utvecklings ryggmärgen. Framför allt har vi fastställt att robo2, robo3 och dcc krävs för commissural Primary ASCENding (CoPA) axonet pathfinding. Använda monterings procedur som beskrivs här, kunde vi undersöka ventrala tillväxt, mittlinjen korsning, commissure bredd, rygg och främre tillväxten 2,3. Detta monteringsförfarande kan också tillämpas på DV eller AP mönstring av ryggmärgen. Vi har använt detta förfarande för att fastställa skilda roller nedströms Wnt effectors i DV-mönstring av ryggmärgen. Med hjälp av denna montering, kunde vi få upplösningen av DV markörer på enskild cellnivå, och bestämma minut mönstring skift som en följd av förändrad Wnt signalmottagning 4,5. Detta montaget möjliggör också mitotiska indexberäkning genom anti phosphohistone 3 eller BrdU märkning (stamfader proliferation) differentiering 5.
Lateral montering av fast zebrafisk embryon hjälpmedel visualisering av ryggmärgsutveckling. Genom borttagande av äggulan bollen, är den arbetsavstånd som krävs för exceptionell mikroskopisk avbildning reduceras. Vår representativa resultat var begränsade till 24 HPF stadiet, dock kan denna teknik användas så tidigt som 18 HPF, men tidigare embryon är svårare att dissekera på grund av storleken på embryot och bräcklighet av vävnaden. Denna teknik är också tillämplig på embryon äldre än 24 HPF. Med hjälp av den optiska klarheten hos den embryonala zebrafisk, förmågan att utföra framåt genetiska skärmar, omvänd genetik, och transgena metoder kan flera utvecklingsprocesser undersökas. Detta inkluderar mitotiska index av neuronala stamceller med markörer som BrdU och anti-fosfor-histon 04-06 Mars och mönstring genom uttryck av neuronala och gliaceller stamceller markörer i pax, nkx, dbx, och olig families 1,4-6. Reagens som rapporterar gliaceller och neuronala bestämning (t.ex. gliafibrillärt syraprotein (GFAP) och Huc / D) 1,4,5,10 kan användas. Neuronal subtyp differentiering kan analyseras genom uttryck av holme, vsx, engrailed och gata gener 1,4-6. Och slutligen, är möjlig analys av Axon vägledning genom antikroppar, såsom anti-acetylerade tubulin, 3A10, och ZNP-1 2,11,12. Även andra ryggradsdjur modellsystem (mus och chick) används för att studera ryggmärgen utveckling endast den zebrafisk tillåter samtidig visning av alla utvecklingsaxlar i den intakta embryot.
Den uppenbara begränsningen till detta tillvägagångssätt är att embryona är fasta, vilket utesluter Bildproduktion. I själva verket är det avlägsnandet av (eller skada på) guleresulterar i snabb embryonal död således inte möjligt att minska arbetsavståndet i levande embryon med användning av denna teknik. Men hög förstoring spinal cord avbildning i levande embryon är möjlig. För att bevara äggulan under live-avbildning, kan embryon placeras i depression diabilder, som ger ett större utrymme mellan provet och täckglas. Alternativt kan flera 22 mm x 22 mm täckglas limmas på endera bilden i en 3 i x 1 i mikroskopisk bild. Täckglasen tjäna som en "bro" för den överliggande täckglas. Om embryon är äldre än 18 HPF är tricaine används för att söva embryon för att förhindra rörelser. Medan ett arbetsavstånd på 0,288 mm för deyolked embryon vid 24 HPF, när man arbetar med levande embryon inbäddade i agaros, med intakta äggulor, räcker en mikroskopisk lins med ett arbetsavstånd på 3,3 mm. Alternativt kan Explantation kulturer härledda från deyolked embryon visualiseras med användning av en plasmakoagel immobiliseringsteknik 13. Olika populationer av celler kan observeras genom användning av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom GFP, mCherry eller photoconkonvertibla färgämne Kaede (för att nämna några). Vidare kan fluorescerande celler i chimär embryon också ses med detta tillvägagångssätt 14.
En konsekvent monteringsteknik som är stabil i månader är ett viktigt verktyg för utvecklings-och cellbiologer. Denna enkla teknik är reproducerbar, vilket möjliggör enkel jämförelse mellan olika experimentella studier. Vidare, anpassningen av embryon i rader tillåter lätt identifiering av specifika embryon för senare analys.
The authors have nothing to disclose.
Skidmore Faculty Development Grant finansierat utarbetandet och offentliggörandet av detta manuskript.
Petri dishes 35mm X 10mm |
VWR |
25373-041 |
Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific |
NC9839169 |
Cover glass |
Fisher Scientific |
12-541-B22X22-1.5 |
Slides |
Fisher Scientific |
12-550-343 |
SlowFade Gold |
Fisher Scientific |
S36936 |
ProLong Gold |
Life Technologies |
P36934 |
Petroleum Jelly |
Any grocery store |
|
Loop Holders |
VWR |
80094-482 |
Insect Pins |
Fine Science Tools |
26002-10 |
Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools |
26016-12
|
Name of Equipment |
Company |
Catalog number |
Olympus Stereo microscope |
Olympus |
SZ61 |