Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen
Summary
Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.
Abstract
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion – – über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.
Introduction
Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt.
Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen – vor allem gentechnisch veränderte Mäuse – haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12.
Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13.
Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie – mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermögli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
