Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen
Summary
Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven. De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.
Abstract
Maïs is wereldwijd een belangrijk graangewas. Gevoeligheid voor biotrofe pathogenen is echter de primaire beperking om de productiviteit te verhogen. U. maydis is een biotrofe schimmelpathogene ziekteverwekker en het oorzakelijk agens van maïssmut op maïs. Deze ziekte is verantwoordelijk voor aanzienlijke opbrengstverliezen van ongeveer $ 1,0 miljard per jaar in de VS1 Verschillende methoden, waaronder vruchtwisseling, fungicidetoepassing en zaadbehandelingen, worden momenteel gebruikt om maïssmut2te beheersen. Gastheerresistentie is echter de enige praktische methode voor het beheren van maïssmut. Identificatie van gewasgewassen, waaronder maïs, tarwe en rijst die resistent zijn tegen verschillende biotrofe pathogenen, heeft de opbrengstverliezen per jaar aanzienlijk verminderdmet 3-5. Daarom zou het gebruik van een pathogene inentingsmethode die de ziekteverwekker efficiënt en reproduceerbaar tussen de plantenbladeren levert, de snelle identificatie van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydisvergemakkelijken. Als, een eerste stap naar het identificeren van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydis, werd een naaldinjectie-inentingsmethode en een resistentiereactiescreeningsmethode gebruikt om maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen te enten te selecteren met een U. maydis-stam en om resistente planten te selecteren.
Maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen, bestaande uit ongeveer 700 planten, werden geplant, ingeënt met een stam van U. maydis, en gescreend op resistentie. De inentings – en screeningsmethoden identificeerden met succes drie teosintelijnen die resistent zijn tegen U. maydis. Hier wordt een gedetailleerd naaldinjectie-inentings- en resistentiereactiescreeningsprotocol voor maïs-, teosinte- en maïs x teosinte-introgressielijnen gepresenteerd. Deze studie toont aan dat naaldinjectie-inenting een onschatbaar hulpmiddel in de landbouw is dat U. maydis efficiënt tussen de plantenbladeren kan leveren en plantenlijnen heeft geleverd die resistent zijn tegen U. maydis die nu kunnen worden gecombineerd en getest in fokprogramma’s voor verbeterde ziekteresistentie.
Introduction
Schimmelziekten van planten vormen een van de meest vooraanstaande bedreigingen voor de landbouw. De noodzaak om gewassen te ontwikkelen met een betere ziekteresistentie neemt toe als gevolg van de voedselbehoeften van een groeiende wereldbevolking. Plantenpathogenen infecteren van nature gewasplanten in het veld en veroorzaken ziekten die de gewasopbrengst negatief beïnvloeden6. Het is aangetoond dat het identificeren en gebruiken van resistente planten de weerstand kan verbeteren en het opbrengstverlies kan verminderen. Resistente cultivars zijn geïdentificeerd in veel plantensoorten, waaronder maïs, tarwe, rijst en sorghum door de planten te enten met een plantenpathogenen en te selecteren voor resistente lijnen7. Daarom zou de ontwikkeling en het gebruik van een efficiënte inentingsmethode het mogelijk maken om veel planten te enten en te screenen op resistentie. Verschillende inentingsmethoden zijn gebruikt, waaronder dip-inenting, het pipetten van de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plant en naaldinjectie-inenting8-11. Bij elke methode moet de ziekteverwekker betrouwbaar worden geïntroduceerd tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria om de ontwikkeling van pathogenen en planteninfectie te garanderen12,13.
De dip-inentingsmethode omvat het onderdompelen van een plantenzaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur, terwijl de pipetteermethode vereist dat de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plantenzaailingen wordt geplaatst. Er zijn echter problemen met beide methoden. Ten eerste zijn beide methoden afhankelijk van de natuurlijke beweging van de ziekteverwekker van het bladoppervlak naar het plantenweefsel, wat zeer variabel is. De meeste ziekteverwekkers komen van nature de plant binnen via stomatale openingen of wonden op het bladoppervlak van de plant. Er is echter een aanzienlijke variabiliteit in het vermogen van de pathogenen om het bladoppervlak van de plant door de huidmondjes en/of wonden op het bladoppervlak te penetreren. Daarom kan de penetratie van ziekteverwekkers niet worden gecontroleerd met een van beide inentingsmethodes die mogelijk leiden tot inconsistente gegevens. Ten tweede, bij het screenen van een groot aantal planten, kan het onderdompelen van de zaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur tijdrovend zijn en het aantal planten beperken dat kan worden gescreend. Omgekeerd levert het hierin beschreven inentingsprotocol voor naaldinjectie de pathogene celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren die de vorming van appressoriavergemakkelijken 14. De ziekteverwekker gebruikt vervolgens de nieuw ontwikkelde appressoria om de plant binnen te komen en het probleem van de penetratie van pathogenen te elimineren. Bovendien biedt het inentingsprotocol voor naaldinjectie een reeks fenotypes voor maïs- en teosinteplanten die zijn ingeënt met U. maydis en een goede infectie aantonen. De fenotypes kunnen worden gebruikt als een marker om de beste concentratie te bepalen voor de pathogene celsuspensiecultuur, wat resulteert in consistente plantenfenotypes binnen en tussen verschillende experimenten.
Na inenting van de plant met een pathogene celsuspensiecultuur worden planten meestal gescreend om een resistent of gevoelig fenotype8-11,15te detecteren. Hoewel ziektebeoordelingsschalen op grote schaal worden gebruikt om plantenfenotypen te screenen en te classificeren, verschillen de beoordelingsschalen afhankelijk van de ziekteverwekker die wordt geanalyseerd. Daarom kan een protocol voor de beoordeling van ziekten voor U. maydis en maïsinteracties worden gebruikt voor vergelijkbare schimmelpathogenen16.
De huidige reeks protocollen beschrijft de inenting van naaldinjecties met een U. maydis celsuspensiecultuur en ziekteresistentiereactiescreening van maïs,teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen. De huidige protocollen zijn niet beperkt tot naaldinjectie-inenting van U. maydis in maïsplanten, maar kunnen worden gebruikt voor relatief elke schimmelpathogene ziekteverwekker en plantensoort. Daarom zullen onderzoekers, door de details van beide methoden in hetzelfde protocol op te nemen, de protocollen voor inenting en screening direct kunnen gebruiken of de oorspronkelijke protocollen kunnen manipuleren om beter te passen bij de pathogene en plantensoorten van belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie was de naaldinjectie-inentingsmethode die werd gebruikt om een stam U. maydis in de stengel van 700 maïs- en teosinteplanten af te leveren succesvol. Bovendien werd een herziene ziekteresistentiebeoordelingsschaal gebruikt om de planten te screenen en de ontwikkeling van pathogenen te detecteren. Als gevolg van het gebruik van beide methoden werden plantenlijnen geïdentificeerd die resistent zijn tegen U. maydis onder 700 maïs- en teosinteplanten die nu kunnen worden gecombineerd en ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Emir Islamovic voor laboratorium- en kashulp. We danken ook Dr. Sherry Flint-Garcia voor het leveren van de maïs x teosinte introgressie lijnen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
