Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von Ustilago-Maydis auf Mais- und Teosintenlinien
Summary
Die Verwendung einer Nadelinjektionsmethode zur Inokulation von Mais- und Teosintenpflanzen mit dem biotrophen Erreger Ustilago maydis wird beschrieben. Die Nadelinjektionsimpfung erleichtert die kontrollierte Abgabe des Pilzerregers zwischen den Pflanzenblättern, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt. Diese Methode ist hocheffizient und ermöglicht reproduzierbare Impfungen mit U. maydis.
Abstract
Mais ist eine wichtige Getreidepflanze weltweit. Die Anfälligkeit für biotrophe Krankheitserreger ist jedoch die haupthindernis für die Steigerung der Produktivität. U. maydis ist ein biotropher Pilzerreger und der Erreger von Maiskot auf Mais. Diese Krankheit ist verantwortlich für erhebliche Ertragsverluste von etwa 1,0 Milliarden US-Dollar jährlich in den USA1 Mehrere Methoden einschließlich Fruchtfolge, Fungizid-Anwendung und Saatgut-Behandlungen werden derzeit verwendet, um Mais-Schmutz2zu kontrollieren. Der Wirtswiderstand ist jedoch die einzige praktische Methode zur Verwaltung des Maisschmutzes. Die Identifizierung von Kulturpflanzen wie Mais, Weizen und Reis, die gegen verschiedene biotrophe Krankheitserreger resistent sind, hat die Ertragsverluste jährlichum 3-5deutlich verringert. Daher würde die Verwendung einer Pathogen-Impfungsmethode, die den Erreger effizient und reproduzierbar zwischen den Pflanzenblättern liefert, die schnelle Identifizierung von Maislinien erleichtern, die gegen U. maydisresistent sind. Als ein erster Schritt zur Indentifizierung von Maislinien, die gegen U. Maydisresistent sind, wurde eine Nadelinjektionsimpfungsmethode und ein Resistenzreaktionsscreening-Verfahren verwendet, um Mais-, Teosinten- und Maisx-Teosinten-Introgressionslinien mit einem U.-Maydis-Stamm zu impfen und resistente Pflanzen auszuwählen.
Mais, Teosinte und Mais x Teosinte-Introgressionslinien, bestehend aus etwa 700 Pflanzen, wurden gepflanzt, mit einem Stamm von U. Maydisgeimpft und auf Widerstand gescreent. Die Impf- und Screening-Methoden identifizierten erfolgreich drei Teosintenlinien, die gegen U. maydisresistent sind. Hier wird ein detailliertes Nadelinjektions-Inokulations- und Resistenzreaktions-Screening-Protokoll für Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien vorgestellt. Diese Studie zeigt, dass Nadelinjektionsimpfung ein unschätzbares Werkzeug in der Landwirtschaft ist, das U. Maydis zwischen den Pflanzenblättern effizient liefern kann und Pflanzenlinien zur Verfügung gestellt hat, die gegen U. Maydis resistent sind, die nun kombiniert und in Zuchtprogrammen zur Verbesserung der Krankheitsresistenz getestet werden können.
Introduction
Pilzkrankheiten von Pflanzen stellen eine der größten Bedrohungen für die Landwirtschaft dar. Die Notwendigkeit, Kulturen mit verbesserter Krankheitsresistenz zu entwickeln, steigt aufgrund des Nahrungsmittelbedarfs einer wachsenden Weltbevölkerung. Pflanzenpathogene infizieren natürlich Pflanzen auf dem Feld und verursachen Krankheiten, die sich negativ auf den Ernteertrag auswirken6. Es hat sich gezeigt, dass die Identifizierung und Verwendung resistenter Pflanzen die Resistenz verbessern und den Ertragsverlust verringern kann. Resistente Sorten wurden in vielen Pflanzenarten wie Mais, Weizen, Reis und Sorghum identifiziert, indem die Pflanzen mit einem Pflanzenpathogen impfen und für resistente Linien7ausgewählt wurden. Daher würde die Entwicklung und Verwendung einer effizienten Impfmethode es ermöglichen, viele Pflanzen zu impfen und auf Resistenzen zu überprüfen. Verschiedene Impfmethoden wurden verwendet, einschließlich Tauchimpfung, Pipettierung der Pathogenzellsuspensionskultur in den Wirbel der Pflanze, und Nadelinjektionsimpfung8-11. Bei jeder Methode muss der Erreger zuverlässig zwischen den Pflanzenblättern eingeschleppt werden, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt, um die Entwicklung von Krankheitserregern und eine Pflanzeninfektion zu gewährleisten12,13.
Die Dip-Impfmethode beinhaltet das Eintauchen einer Pflanzensämling in eine Pathogenzellsuspensionskultur, während die Pipettiermethode erfordert, die Krankheitserregern-Zellsuspensionskultur in den Wirbel des Pflanzensämlings zu legen. Es gibt jedoch Probleme mit beiden Methoden. Erstens hängen beide Methoden von der natürlichen Bewegung des Erregers von der Blattoberfläche in das sehr variabel emittische Gewebe ab. Die meisten Krankheitserreger gelangen auf natürliche Weise durch stomataale Öffnungen oder Wunden auf der Pflanzenblattoberfläche in die Pflanze. Es gibt jedoch erhebliche Variabilität in der Fähigkeit der Krankheitserreger, die Pflanzenblattoberfläche durch die Stomata und/oder Wunden auf der Blattoberfläche zu durchdringen. Daher kann die Durchdringung von Krankheitserregern nicht mit einer der beiden Impfmethoden kontrolliert werden, die möglicherweise zu inkonsistenten Daten führen. Zweitens kann das Eintauchen der Sämlinge in eine Pathogenzellsuspensionskultur zeitaufwändig sein und die Anzahl der Pflanzen begrenzen, die gesiebelt werden können. Umgekehrt liefert das hier beschriebene Nadelinjektionsimpfungsprotokoll die Pathogenzellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern, die die Bildung von Appressadeia14erleichtert. Der Erreger nutzt dann die neu entwickelte Appressade, um in die Pflanze einzudringen, um das Problem der Pathogenpenetration zu beseitigen. Zusätzlich bietet das Nadelinjektions-Impfprotokoll eine Reihe von Phänotypen für Mais- und Teosintenpflanzen, die mit U. Maydis geimpft wurden und eine gute Infektion nachweisen. Die Phänotypen können als Marker verwendet werden, um die beste Konzentration für die Pathogenzellsuspensionskultur zu bestimmen, was zu konsistenten pflanzenphänotypen innerhalb und zwischen verschiedenen Experimenten führt.
Nach der Pflanzenimpfung mit einer Pathogenzellsuspensionskultur werden Pflanzen in der Regel gesiescreent, um einen resistenten oder anfälligen Phänotyp8-11,15zu erkennen. Während Krankheitsbewertungsskalen ausgiebig verwendet wurden, um Pflanzenphänotypen zu untersuchen und zu klassifizieren, unterscheiden sich die Bewertungsskalen je nach analysiertem Erreger. Daher kann eine Krankheitsbewertungsskala Protokoll Einrichtung für U. Maydis und Mais Wechselwirkungen für ähnliche Pilzerreger verwendet werden16.
Die vorliegende Reihe von Protokollen beschreibt die Nadelinjektionsimpfung mit einer U. Maydis-Zellsuspensionskultur und dem Krankheitsresistenz-Reaktionsscreening von Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien. Die vorliegenden Protokolle beschränken sich nicht auf die Nadelinjektionsimpfung von U. maydis in Maispflanzen, sondern können für relativ alle Pilzpathogene und Pflanzenarten verwendet werden. Daher wird die Einbeziehung der Einzelheiten beider Methoden in ein und demselben Protokoll es den Forschern ermöglichen, die Protokolle für die Impfung und das Screening direkt zu nutzen oder die ursprünglichen Protokolle zu manipulieren, um den Pathogen und die Pflanzenarten besser in das Interesse von Pflanzen zu passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie war die Nadelinjektionsimpfungsmethode, mit der ein Stamm von U. Maydis in den Stamm von 700 Mais- und Teosintenpflanzen geliefert wurde, erfolgreich. Zusätzlich wurde eine überarbeitete Seuchenresistenz-Bewertungsskala verwendet, um die Pflanzen zu untersuchen und die Entwicklung von Krankheitserregern zu erkennen. Als Ergebnis der Verwendung beider Methoden wurden Pflanzenlinien, die gegen U. Maydis resistent sind, unter 700 Mais- und Teosintenpflanzen identifiziert, die nun kombini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Emir Islamovic für die Labor- und Gewächshaushilfe. Wir danken auch Dr. Sherry Flint-Garcia für die Bereitstellung der Mais x Teosinte Introgressionslinien.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
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