Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

Summary

La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l'enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte.

Abstract

La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né demeure un défi important. Approches pour inhiber la neurogenèse adulte via livraison virale invasive ou des animaux transgéniques ont confond potentiels qui rendent l'interprétation des résultats de ces études difficile. De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent d'enquêter de manière non invasive une fonction de certains groupes de neurones adultes-né grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants focale inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et permet le ciblage des régions spécifiques progénitrices neurales. Afin d'éclairer le rôle fonctionnel potentiel que la neurogenèse adulte hypothalamique joue dans la régulation des processus physiologiques, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus. Nous décrivons une méthode pour C omputer tomographie guidéef ocal IR (CFIR) pour permettre la livraison anatomique précise et exacte ciblant les petits animaux. CFIR utilise tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose de rayonnement, réduit au minimum l'exposition au rayonnement de régions du cerveau non ciblés, et permet une distribution de dose conforme aux limites de faisceaux tranchants. Ce protocole permet de poser des questions concernant la fonction des neurones adultes-né, mais ouvre aussi des zones à des questions dans les domaines de la radiobiologie, la biologie de la tumeur, et de l'immunologie. Ces outils radiologiques faciliteront la traduction des découvertes sur le banc au chevet.

Introduction

Des découvertes récentes ont démontré que le cerveau des mammifères adultes peuvent subir un degré remarquable de plasticité. neurones adultes nés sont générés à l'âge adulte dans des niches spécialisées du cerveau des mammifères ^1. Quelle est la fonction de ces neurones adultes-né? Et d'autant plus, ils jouent un rôle dans ne physiologie et le comportement? Les études sur ce sujet sont traditionnellement concentrées sur la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire de l'hippocampe, mais des études récentes ont caractérisé la neurogenèse dans d'autres régions du cerveau comme l'hypothalamus chez les mammifères ^2. Neurogenèse a été rapporté dans le post-natale et l'hypothalamus adulte ^2-10, et la fonction de ces neurones hypothalamiques nouveau-nés demeure une zone active de l'enquête.

La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né reste un défi important pour le domaine des neurosciences en général. L'inhibition sélective de specIFIC populations de cellules progénitrices neurales reste limitée par le manque de marqueurs moléculaires disponibles qui sont uniques aux populations progénitrices neurales simples ^11. Ainsi, la suppression sélective des neurones adultes nés de ces progéniteurs neuronaux via le ciblage génétique reste difficile. De même, la livraison virale de cibler les neurones adultes-né souffre de variables confondantes potentielles telles que l'introduction des blessures et de l'inflammation dans l'environnement ^12.

De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent de contourner ces facteurs de confusion et d'enquêter à ces questions grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et une méthode non invasive permet de cibler les populations progénitrices neurales ^13-15. Récemment, nous avons décrit une région germinale de l'éminence médiane de l'hypothalamus chez les mammifères (ME) que nous avons appelé la zone proliférative hypothalamique (HPZ) ² </sup>. Nous avons constaté que lorsque les jeunes souris femelles adultes ont été soumis à un régime riche en graisses (HFD), les niveaux de la neurogenèse chez les souris HFD nourris étaient sensiblement plus élevés que leur bouffe normale (NC) contrôles nourris dans cette région ME ^2. Pour tester si la neurogenèse adulte dans le ME hypothalamique régule le métabolisme et le poids, nous avons cherché à perturber ce processus. L'éminence médiane est une petite structure unilatérale à la base du troisième ventricule à partir de laquelle hormones de régulation sont libérés. Afin d'inhiber la prolifération et la neurogenèse ultérieure sans altérer les autres fonctions physiologiques de cette région du cerveau, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nouvellement nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus ^2.

Un certain nombre de groupes ont utilisé le rayonnement de supprimer la neurogenèse dans les régions canoniques ^14-28. Cependant, les approches radiologiques précédentes ont généralement ciblé les grandes surfaces, ou Often involontairement également ciblé plusieurs zones du cerveau où la neurogenèse a été signalée, ce qui rend difficile d'associer sans ambiguïté les défauts comportementaux observés avec des défauts dans des populations particulières progénitrices neurales. La capacité de l'irradiation plus ciblée est assurée par des plateformes radiologiques qui combinent c omputer imagerie de tomographie guidée avec f ocal ir faisceau rayonnement (CFIR) livraison pour permettre un ciblage précis anatomique ^29-36. Faisceaux de rayonnement aussi faibles que 0,5 mm de diamètre sont disponibles pour cibler des populations de cellules progénitrices neurales spécifiques ^35. Cette méthode nous permet de cibler le ME hypothalamique et arrêtons prolifération et bloquons la neurogenèse chez les petits animaux. Après le traitement radiologique sur ces populations de cellules progénitrices, des tests physiologiques et comportementales peuvent être effectuées pour éclairer la fonction potentiel des cellules adultes-né. Ciblage focale est particulièrement important pour notre application depuis lehypophyse est situé à proximité de l'éminence médiane de l'hypothalamus, de l'hypophyse irradiation peut affecter la fonction hormonale et ensuite brouiller les résultats.

La base biologique pour la répression de la neurogenèse après irradiation ne sait toujours pas. Études sur les radiations précédents se sont appuyés sur de grosses poutres de la région, et ont conclu que la suppression de la neurogenèse est médiée par une réponse inflammatoire ^{14, 37.} Comme tel, il est difficile de savoir si l'irradiation très focal pourrait supprimer la neurogenèse, car il n'évoque pas une réaction inflammatoire importante. Cependant, des études récentes par notre groupe de la région neurogène classique dans l'hippocampe ont démontré que l'irradiation très focal avec une dose de 10 Gy peut supprimer la neurogenèse pendant au moins 4 semaines après l'irradiation ^35.

Pour interroger la fonction des neurones hypothalamiques adultes nés dans l'éminence médiane, nous utilisons un rayonnement de précision dériphérique capable de fournir l'imagerie CT en combinaison avec des faisceaux de rayonnement de faible diamètre ME inhiber la neurogenèse. L'utilisation d'un tube à rayons X fixé à un support mobile qui tourne sur une plage de 360 °, nous fournissons arc-faisceau faisceau de micro-irradiation à l'aide d'une platine porte-objet commandé par robot qui permet la rotation d'un sujet animal au cours du traitement de rayonnement (Figure 1) . Un détecteur de rayons X à haute résolution est utilisé pour acquérir des images lorsque le support mobile est dans la position horizontale ^33. Pour cette étude, les images TDM ont été reconstituées avec une taille de voxel isotrope de 0,20 mm. Imagerie de bord CT a permis l'identification d'une cible alors que l'animal se trouve dans la position de traitement. La cible a été localisé à l'aide du logiciel de planification de la navigation dose-CT, qui a été inclus dans notre plate-forme radiologique disponible dans le commerce. Après localisation de notre ROI par imagerie CT, l'animal a été déplacé vers la position de traitement approprié par l'étage robotique de spécimen qui a quatre degrees de liberté (X, Y, Z, θ). Grâce à une combinaison de portiques et la scène de robot angles, poutres peuvent être livrés à partir de presque n'importe quelle direction par rapport à l'animal, et les traitements en forme d'arc stéréotaxiques sont possibles ^29. Pour ces tous et d'autres études d'imagerie, les souris ont été placées dans un dispositif d'immobilisation qui permet la livraison de gaz isoflurane anesthésie tout en limitant le mouvement. Le lit d'immobilisation est compatible CT, et se connecte à l'étage de spécimen robotisé ^34.

Nous nous attendons à ce que CFIR fournira avancées conceptuelles dans un certain nombre de domaines de recherche. Bien que nous utilisions le ciblage radiologique de l'éminence médiane de l'hypothalamus comme preuve de principe de cette technique, CFIR peut être utilisé pour cibler n'importe quelle région du corps d'un petit organisme modèle en principe. Dans le domaine des neurosciences, par exemple, nous envisageons cette technique pourrait être utilisée pour évaluer la fonction de populations de cellules progénitrices activement prolifératifs qui ont été proposés à exist dans d'autres organes, tels que circumventriculaires la région postrema ^{38, 39,} subfornical organe ^40, et ⁴¹ l'hypophyse. Controverses de longue date concernant le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte et identifiant un rôle causal dans le comportement peuvent désormais être mieux pris en compte. Dans chanteur, cette technique pourrait aborder le rôle de la neurogenèse adulte dans le maintien du comportement robuste et saisonnière de chants d'oiseaux ^42, qui a été entravée par la capacité d'inhiber sélectivement la neurogenèse dans des régions spécifiques du cerveau. La compréhension de ce modèle de comportement robuste pourrait jeter un nouvel éclairage sur le rôle de la neurogenèse adulte dans la régulation d'autres comportements dimorphisme sexuel. En variante, dans le domaine du métabolisme, CFIR pourrait être utilisé pour explorer les aspects du rôle de la prolifération des hépatocytes et son rôle dans le métabolisme et la balance énergétique. La possibilité pour l'avance conceptuelle dans plusieurs disciplines de recherche est renforcée par l'introduction de cette technique.

<p class= "Jove_content"> Dans cet article, nous démontrons les capacités de CFIR de précision anatomique ciblage d'un faisceau d'irradiation focale. Bien que nous avons d'abord développé cette plate-forme de recherche sur les petits rayonnement animale (SARRP) pour nos études, d'autres dispositifs similaires sont maintenant disponibles dans le commerce qui peut accomplir tomodensitométrique similaire irradiation focale ^{43, 44.} Par conséquent, nous généralisons ce protocole de CFIR avec des étapes nécessaires pour toutes les plateformes de recherche plutôt que celles qui sont spécifiques pour SARRP. Les avantages de CFIR par rapport aux approches radiologiques précédentes pour inhiber la neurogenèse sont que cette technique permet tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose, la dose conforme minimise l'exposition de régions du cerveau non ciblés, et de la géométrie du faisceau de haute précision permet une distribution de dose conforme à tranchants limites de faisceau. Nous décrivons comment utiliser l'imagerie CT-guidée de cibler la dose à une région anatomique spécifique, et en faisant ainsi, comment visualiser le rayonnementRépartition de la dose directement dans le tissu en utilisant une coloration immunohistochimique pour γ-H2AX, un marqueur de cassures double brin ^{35, 45-48.} L'utilisation de cette approche pour l'irradiation sélective des niches neurogène peut avoir des conséquences importantes en révélant le rôle fonctionnel de nouveaux neurones adultes-né sur la physiologie et la maladie.

Protocol

utilisation des animaux Obtenir l'approbation du Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel pour les protocoles de soins standard et l'utilisation. Le protocole actuel est développé pour des études d'irradiation de 5,5 à 10 semaines d'intervention sur des souris adultes âgés C57BL6 / J, comme décrit précédemment (figure 2) 2. Cependant, d'autres âges et petites espèces animales (rats, hamsters, écureuils terr…

Representative Results

Évaluation de ciblage tomodensitométrique et précision L'étalonnage du système mécanique est essentielle pour assurer que les faisceaux de différents angles tous se coupent en un seul point. L'étalonnage a été réalisé avec un procédé à base de formation d'image à semi-automatique, où la précision de l'alignement bout-à-bout a été mesuré à 0,2 mm 29. Cette précision est très critique à mesure que le volume de la structure de l'éminence m?…

Discussion

Irradiation focale tomodensitométrique (CFIR) est une approche nouvelle et complète du système capable de fournir des champs de rayonnement à des cibles dans les petits animaux sous contrôle robotique utilisant CT-guidage ^32. La capacité de CFIR à fournir des faisceaux très ciblés à de petits modèles animaux offre de nouvelles possibilités de recherche pour combler la recherche en laboratoire et la traduction clinique. Ce document décrit l'approche de CFIR pour la livraison de rayonnement pr?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
SARRP research platform	Xstrahl	RS225A	http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker	Xstrahl		Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film	IPS	GAFchromic ETB2
Mouse phantom	Gammex	457	Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody	Millipore, Inc.	05-636	clone JBW301
High-fat rodent diet	Research Diets	D12492i	60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	10019-360-40
0.01 M Sodium citrate	Fisher Scientific		1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
DAPI	Fisher Scientific		nuclear counterstain
Mounting medium	Fisher Scientific		Vectashield or Gelvatol is preferred