Funktionell Förhör av Adult Hypothalamic neurogenes med Focal Radiological Hämning

Summary

Funktionen för vuxna födda nervceller däggdjurs förblir ett aktivt område för utredning. Joniserande strålning hämmar uppkomsten av nya nervceller. Med hjälp av datortomografi-guidad fokal bestrålning (CFIR), kan tredimensionella anatomiska inriktning på specifika neurala stamceller populationer nu användas för att bedöma den funktionella rollen av vuxen neurogenes.

Abstract

Den funktionella karakterisering av vuxna födda nervceller är fortfarande en stor utmaning. Metoder för att hämma vuxen neurogenes via invasiv viral leverans eller transgena djur har potentiella blandar ihop som gör tolkningen av resultaten från dessa studier är svårt. Nya radiologiska verktyg växer fram, men som tillåter en att icke-invasivt undersöka funktionen av utvalda grupper av vuxna födda nervceller genom noggrann och exakt anatomisk inriktning på små djur. Focal joniserande strålning hämmar födelsen och differentiering av nya nervceller, och tillåter inriktning av specifika neurala stamceller regioner. För att belysa den potentiella funktionella roll som vuxna hypotalamus neurogenes spelar i regleringen av fysiologiska processer, utvecklade vi en icke-invasiv samlingspunkt bestrålning teknik för att selektivt hämma uppkomsten av vuxna födda nervceller i hypotalamus median eminens. Vi beskriver en metod för C omputer tomografi styrdf OCAL ir strålning (CFIR) leverans för att möjliggöra exakt och noggrann anatomisk inriktning på små djur. CFIR använder tredimensionella volymetriska bildstyrning för lokalisering och inriktning av stråldosen, minimerar strålningsexponering för icke-målbestämd hjärnregioner, och möjliggör konforma dosfördelning med skarpa balk gränser. Detta protokoll gör att man kan ställa frågor om funktionen av vuxna födda nervceller, men också öppnar områden för frågor av radiobiologi, tumörbiologi och immunologi. Dessa radiologiska verktyg kommer att underlätta översättningen av upptäckter på bänken till sängkanten.

Introduction

Nya upptäckter har visat att den vuxna däggdjurshjärnan kan genomgå en anmärkningsvärd grad av plasticitet. Vuxna födda nervceller genereras under hela vuxenlivet i specialiserade nischer i däggdjurshjärnan ^1. Vad är funktionen av dessa vuxna födda nervceller? Och mer så, de spelar en roll i fysiologi och beteende? Studier av detta ämne har traditionellt fokuserat på subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna och subgranular zonen i hippocampus, men har nya studier karaktäriseras neurogenes i andra hjärnregioner som däggdjur hypotalamus ^2. Neurogenes har rapporterats i postnatal och vuxna hypotalamus ^2-10, och funktionen av dessa nyfödda hypotalamus nervceller är fortfarande ett aktivt område för utredning.

Den funktionella karakterisering av vuxna födda nervceller fortfarande en betydande utmaning för neurovetenskap fältet i allmänhet. Selektiv hämning av specific neurala stamceller populationer fortfarande begränsad av bristen på tillgängliga molekylära markörer som är unika för enskilda neurala stamceller populationer ^11. Således återstår svåra selektiv radering av vuxna födda nervceller från dessa neurala stamceller via genetisk inriktning. Likaså lider viralt leverans att rikta vuxna födda nervceller från potentiella störfaktorer såsom att införa skada och inflammation i miljön ^12.

Nya radiologiska verktyg växer fram, men som tillåter en att kringgå dessa blandar ihop och utreda dessa frågor genom noggrann och exakt anatomisk inriktning på små djur. Joniserande strålning hämmar födelsen och differentiering av nya nervceller, och gör en icke-invasiv metod för att rikta neurala stamceller populationer ^13-15. Nyligen beskrev vi en stilbildande region av däggdjur hypotalamus median eminence (ME) som vi kallas hypotalamus proliferativ zonen (HPZ) ² </sup>. Vi fann att när unga vuxna honmöss fick en fettrik kost (HFD), var nivåerna av neurogenes i HFD-matade möss betydligt högre än deras normala chow (NC) matade kontroller i detta ME region ^2. För att testa om adult neurogenes i den hypotalamiska ME reglerar metabolismen och vikt, sökte vi att störa denna process. Den median eminens är en liten ensidig struktur vid basen av den tredje ventrikeln från vilken reglerande hormoner frigörs. För att förhindra spridning och efterföljande neurogenes utan att ändra de andra fysiologiska funktioner i denna hjärnregion, utvecklade vi en icke-invasiv samlingspunkt bestrålning teknik för att selektivt hämma uppkomsten av nyfödda vuxna nervceller i hypotalamus median eminens ^2.

Ett antal grupper har använt strålning för att undertrycka neurogenes i kanoniska områdena ^14-28. Däremot har tidigare radiologiska metoder generellt riktade stora områden, eller often oavsiktligt också riktade flera områden i hjärnan där neurogenes har rapporterats, vilket gör det svårt att entydigt knyta eventuella beteendemässiga brister som observerats med defekter i specifika neurala stamceller populationer. Möjligheten till mer riktad strålning ges av radiologiska plattformar som kombinerar c omputer tomografi styrd avbildning med f OCAL stråle ir strålning (CFIR) leverans för att möjliggöra noggrann anatomisk inriktning ^29-36. Strålar så små som 0,5 mm i diameter finns att rikta specifika neurala stamceller populationer ^35. Denna metod gör det möjligt för oss att rikta hypotalamus ME och arrestera spridning och blockera neurogenes i små djur. Efter radiologisk behandling på dessa progenitorceller populationer kan fysiologiska och beteendemässiga tester utföras för att belysa de potentiella funktion av vuxna födda celler. Focal inriktning är särskilt viktigt för vår ansökan eftersomhypofysen ligger nära hypothalamus median eminens, bestrålning av hypofysen kan påverka hormonfunktion och därefter förväxla resultat.

Den biologiska grunden för undertryckande av neurogenes efter bestrålning är fortfarande oklart. Tidigare studier strålning har förlitat sig på stora området balkar, och har dragit slutsatsen att undertryckandet av neurogenes förmedlas genom ett inflammatoriskt svar ^{14, 37.} Som sådan är det oklart om mycket fokus bestrålning kunde dämpa neurogenes, eftersom den inte framkallar en betydande inflammatorisk reaktion. Men senare studier av vår grupp av den klassiska neurogen regionen i hippocampus visat att mycket fokus bestrålning med en dos av 10 Gy kan dämpa nybildning av nervceller i minst 4 veckor efter bestrålning ^35.

Att förhöra funktionen av vuxna födda hypotalamus nervceller i median eminens, använder vi en precisionsstrålning dEvice kan leverera CT i kombination med strålar med liten diameter för att hämma MIG neurogenes. Med användning av ett röntgenrör fäst vid en gantry som roterar över ett område av 360 °, levererar vi arc-beam mikro bestrålning stråle med användning av en robot styrd prov stadium som tillåter rotation hos en djurpatient under strålningsbehandling (figur 1) . En röntgendetektor med hög upplösning användes för att förvärva bilder när gantry är i horisontellt läge ^33. För denna studie var CT-bilder rekonstrueras med en isotrop voxelstorlek av 0,20 mm. Ombord CT medgav identifiering av ett mål under det att djuret är i behandlingsposition. Målet lokaliserades med hjälp av CT-navigering dos-planering programvara, som ingick i vår kommersiellt tillgänglig radiologiska plattform. Efter att lokalisera vår ROI med CT, var djuret flyttas till lämplig behandling läge av robot provet scenen som har fyra graderrees frihets (X, Y, Z, θ). Genom en kombination av portal och robotscenvinklar, kan balkar levereras från nästan alla håll i förhållande till djuret, och stereotaktiska båge-liknande behandlingar är möjliga ^29. För dessa och alla andra som avbildar studier, mössen placeras i en immobilisering enhet som tillåter leverans av bedövningsmedel isofluran gas samtidigt begränsa rörelse. Immobilisering sängen är CT-kompatibel, och ansluter till robotprovet stadiet ^34.

Vi förväntar oss att CFIR ger konceptuella framsteg inom ett antal forskningsområden. Även om vi använder radiologisk inriktning av hypotalamus median eminens som bevis på principen för denna teknik, kan CFIR användas för att rikta varje region i kroppen av alla små modellorganism i princip. I neurosciencesna exempelvis föreställer vi denna teknik skulle kunna användas för att utvärdera funktionen av aktivt proliferativa gångarpopulationer som har föreslagits för att exist på andra circumventricular organ, såsom området postrema ^{38, 39,} subfornikala organet ^40, och hypofysen ^41. Mångåriga kontroverser kring den funktionella rollen av vuxen neurogenes och identifiera en kausal roll i beteende kan också nu att hanteras bättre. I song kan denna teknik upp den roll vuxen neurogenes i att upprätthålla den robusta och säsongs beteende fågelsång ^42, som har hindrats av förmågan att selektivt inhibera neurogenes i specifika hjärnregioner. Att förstå denna robusta beteendemodellen kan kasta nytt insikt i den roll som vuxen neurogenes i regleringen av andra sexuellt dimorfa beteenden. Alternativt kan i den metaboliska fältet CFIR skulle kunna användas för att undersöka aspekter av rollen av hepatocytproliferation och dess roll i metabolism och energibalans. Möjligheten för konceptuella framsteg inom flera forskningsdiscipliner förstärks genom införandet av denna teknik.

<p class= "Jove_content"> I detta papper, vi undersöka möjligheterna med CFIR för precisions anatomisk inriktning av en fokal strålningsstråle. Även om vi från början utvecklat denna lilla djur strålning forskningsplattform (SARRP) för våra studier, andra liknande enheter är nu kommersiellt tillgängliga som kan utföra liknande CT-guidad fokal bestrålning ^{43, 44.} Därför generalisera vi denna CFIR protokoll med åtgärder som krävs för alla forskningsplattformar snarare än specifika för SARRP. Fördelarna med CFIR över tidigare radiologiska metoder för att hämma neurogenes är att denna teknik möjliggör tredimensionella volymetriska bildstyrning för lokalisering och inriktning av dosen, minimerar konform dos exponering för icke-målbestämd hjärnregioner, och hög precision beam geometri möjliggör konform dosfördelning med skarpa balk gränser. Vi beskriva hur man använder CT-guidad imaging att rikta dosen till en specifik anatomisk region, och på så sätt hur man kan visualisera strålningdosera fördelning direkt i vävnad med hjälp av immunhistokemisk färgning för γ-H2AX, en markör för DNA-dubbelsträngade avbrott ^{35, 45-48.} Användningen av denna metod för selektiv bestrålning av neurogena nischer kan få betydande konsekvenser i att avslöja den funktionella rollen av nya vuxna födda nervceller om fysiologi och sjukdomar.

Protocol

Animal Usage Erhålla godkännande från institutionella Animal Care och användning kommittén för standardvård och använda protokollen. Det nuvarande protokollet var utvecklad för fokala bestrålningsstudier på 5,5 till 10 veckor gamla vuxna C57BL6 / J-möss, såsom beskrivits tidigare (figur 2) 2. Men andra åldrar och små djurarter (råtta, hamstrar, slipade ekorrar, etc.) kan också användas, förutsatt att effektiva anestesiprotokoll och en radi…

Representative Results

Bedöma CT-guidad inriktning och Noggrannhet Den mekaniska kalibrering av systemet är kritisk för att säkerställa att strålarna från olika vinklar alla skär varandra i en enda punkt. Kalibrering utfördes med en halvautomatisk imaging-baserad metod, där end-to-end inriktningsnoggrannhet har uppmätts till 0,2 mm 29. Denna noggrannhet är mycket kritisk eftersom volymen av hypotalamus median eminens struktur är liten 2. För att testa denna kalibrering, mätte vi d…

Discussion

CT-guidad fokal bestrålning (CFIR) är ett nytt och komplett system tillvägagångssätt kan leverera strålningsfält till målen i små djur under robotkontroll med hjälp av CT-vägledning ^32. Möjligheten att CFIR att leverera mycket fokuserade strålar till små djurmodeller ger nya forskningsmöjligheter för att överbrygga laboratorieforskning och klinisk översättning. Detta dokument beskriver CFIR strategi för exakt strålning leverans att särskilt inrikta en hypotalamus neurala progenitorceller…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
SARRP research platform	Xstrahl	RS225A	http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker	Xstrahl		Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film	IPS	GAFchromic ETB2
Mouse phantom	Gammex	457	Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody	Millipore, Inc.	05-636	clone JBW301
High-fat rodent diet	Research Diets	D12492i	60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	10019-360-40
0.01 M Sodium citrate	Fisher Scientific		1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
DAPI	Fisher Scientific		nuclear counterstain
Mounting medium	Fisher Scientific		Vectashield or Gelvatol is preferred