פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.
מאמצים כבר התמקדו בפיתוח במבחני חוץ גופית ללימוד microvessels משום in vivo מחקרים בבעלי החיים נמצאים זמן רב יותר, יקר, ותצפית וכימות הם מאוד מאתגרים. עם זאת, יש לי קונבנציונלי במבחני microvessel מבחנה מגבלות כאשר מייצגים in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה תלת ממדי (3D) ומתן זרימת נוזל רציף. באמצעות שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה, פיתחנו endothelialized חתך עגול רב מעמיק microchannels-on-a-chip, אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זלוף הרציף המבוקר זרימה. Photoresist reflowable חיובי שימש לפברק עובש הורים עם רשת microchannel חתך חצי עגולה. על ידי היישור והמליטה של שני polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated מעובש האב, רשת microchannel גלילית נוצרה. בקטרים של microchannels יכולים להיות מבוקרים היטב. בנוסף לכך, תאים ראשוניים אדם טבור וריד אנדותל (HUVECs) נזרעו בתוך השבב הראו כי התאים מרופדים משטח הפנימי של microchannels תחת זלוף המבוקר שנמשך פרק זמן בין 4 ימים ועד 2 שבועות.
Microvessels, כחלק ממערכת מחזור הדם, לתווך האינטראקציות בין דם וברקמות, תומך בפעילות המטבולית, להגדיר microenvironment רקמות, ולשחק תפקיד קריטי במצבים פתולוגיים רבות ובריאות. שחזור של microvessels תפקודי במבחנה יכול לספק פלטפורמה למחקר של תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מקובל במבחני microvessel מבחנה, כגון מבחני נדידת תאי אנדותל, מבחני היווצרות צינור אנדותל, מבחני טבעת אבי העורקים חולדה ועכבר, לא מצליחין לשחזר את in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה (3D) תלת ממדים ובקרת זרימה רציפה 1-8. מחקרים של microvessels באמצעות מודלים של בעלי חיים ובמבחני vivo, כגון assay אנגיוגנזה בקרנית, assay אנגיוגנזה קרום chorioallantoic אפרוח, וassay תקע Matrigel, הם יותר גוזלים זמן, גבוהים בעלות, מאתגרים ביחס להתבוננות וquantifications, ולהעלות סוגיות אתיות 1, 9-13.
התקדמות בmicromanufacturing וטכנולוגיות שבב microfluidic אפשרה מגוון של תובנות המדעים ביו תוך צמצום העלויות והמורכבויות הניסיוניות הגבוהות הקשורות בבעלי חיים ובvivo 14 מחקרים, כגון תנאים ביולוגיים לשלוט בקלות ובאופן הדוק וסביבות fluidic דינמיות, שלא היה היה אפשרי עם טכניקות macroscale קונבנציונליות.
כאן, אנו מציגים גישה לבנות endothelialized microchannels-on-a-chip אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת על ידי שימוש בשילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה.
1. ייצור עובש מאסטר
אחד העקרונות המנחים את עיצוב ולmorphometry כלי דם ידוע כדין של מוריי 16, שבו נקבע כי חלוקת קטרי כלי ברחבי הרשת נשלטת על ידי שיקול מינימום אנרגיה. גם הוא קובע כי הקובייה של הקטרים של כלי הורה בהסתעפות שווה לסכ…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF 1,227,359), תכנית WVU EPSCoR מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (EPS-1,003,907), המשרד מראש WVU בחסות הקרן הלאומי למדע (1,007,978), וWVU PSCoR, בהתאמה. עבודת microfabrication נעשתה במתקני WVU משותפים מחקר (מתקני חדר נקיים) ומחקר נייד אינטגרטיבית Microfluidic במעבדת צ'יפ (שבב מעבדה) באוניברסיטת וירג'יניה המערבית. ההדמיה confocal נעשתה במתקן ההדמיה מיקרוסקופ WVU.
Reagent/Material | |||
Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
Dextran | Sigma | 95771 | |
3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
Equipment | |||
Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |