Mikrofluid On-chip Capture-cycloadditionsreaktion reversibelt Immobilisere små molekyler eller Multikomponenttekstilprodukter strukturer biosensoranvendelser
Summary
Vi præsenterer en metode til hurtig, reversibel immobilisering af små molekyler og funktionaliserede nanopartikler forsamlinger for Surface (SPR) undersøgelser, ved hjælp af sekventiel on-chip bioorthogonal cykloaddition kemi og antistof-antigen capture.
Abstract
Metoder til hurtig overflade immobilisering af bioaktive små molekyler med kontrol over orientering og immobilisering tæthed er særdeles ønskeligt for biosensor og microarray applikationer. I denne undersøgelse, bruger vi en meget effektiv covalent bioorthogonal [4 +2] cykloaddition reaktion mellem trans-cycloocten (TCO) og 1,2,4,5-tetrazin (Tz) for at aktivere mikrofluid immobilisering af TCO / Tz-derivatiserede molekyler . Vi overvåger processen i realtid under kontinuerlig strømning ved hjælp af overflade (SPR). For at aktivere reversibel immobilisering og udvide den eksperimentelle sensorens overflade kombinerer vi en ikke-kovalent antigen-antistof-capture komponent med cycloaddition reaktion. Ved skiftevis at præsentere TCO eller TZ dele til sensoroverfladen, flere capture-cycloaddition processer er nu muligt på en sensor overflade for on-chip montage og interaktion undersøgelser af en række flerkomponent-strukturer. Vi illustrate denne metode med to forskellige immobiliseringsmetoder eksperimenter på en biosensor chip, et lille molekyle, AP1497, der binder FK506-bindende protein 12 (FKBP12), og den samme lille molekyle som del af et immobiliseret, og in situ-funktionaliserede nanopartikler.
Introduction
Effektive konjugeringsreaktioner er værdifulde værktøjer til fastgørelse bioaktive molekyler til overflader til forskellige bioteknologiske anvendelser. For nylig har den meget hurtige bioorthogonal [4 +2] cycloaddition reaktion mellem trans-cycloocten (TCO) og 1,2,4,5-tetrazin (Tz) blevet anvendt til at mærke celleoverflader, subcellulære strukturer, antistoffer og nanopartikler 1. – 7 Her bruger vi [4 +2] cycloadditionsreaktion i kombination med antigen / antistof-capture (GST / anti-GST) til reversibel on-chip syntese af multi-komponent strukturer for Surface (SPR) interaktion analyse og overvåge proces i realtid (Figur 1). 8,9 Især capture-cykloaddition strategi gør det muligt overflade regeneration ved hjælp af en fastlagt protokol. 8. Som følge heraf samling af stabile sensor overflader med kontrol over ligand orientering og tæthed for forskellige nye assay formater er nu muligt. Brugdenne strategi vi vise immobilisering af TCO / Tz-derivatiserede små molekyler og karakterisere cycloaddition satser i en række forskellige bufferbetingelser. Vi valgte den velkendte vekselvirkning mellem FKBP12 og et molekyle, AP1497, der binder FKBP12 10-12 som et eksempel for at kontrollere, at indfangning-cykloaddition strategi bevarer evnen af lille molekyle til at interagere med sit mål, når enten direkte knyttet til immobiliserede GST-antigener eller immobiliserede nanopartikler (NPS).
Denne metode giver flere fordele. Først reversibel immobilisering af små molekyler på sensorchips er nu muligt. For det andet, TCO / Tz immobilisering af små molekyler også mulighed label-fri interaktionsundersøgelser der vende retningen af kanoniske SPR undersøgelser, og kan give en supplerende visning af en bindende interaktion. For det tredje, denne metode gør det muligt mikrofluid syntese af målrettede nanopartikler, og øjeblikkelig vurdering af deres binding eng egenskaber. Det tegner til at forbedre effektiviteten af evaluering eller screening målrettede nanopartikler, og også mindske mængden af nanopartikler, der kræves. 13-15 fjerde kan denne tilgang måle reaktionskinetik af bioorthogonal cykloaddition reaktioner i realtid under konstant flow. Endelig TCO / Tz immobilisering kemi er robust i tilstedeværelse af serum. Tilsammen forventer vi, at denne alsidige fremgangsmåde stort set vil lette konstruktion af stabile sensor overflader til en lang række mikrofluide undersøgelser med relevans for in vitro og in vivo cellulære applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne capture-cykloaddition metode muliggør hurtig, reversibel immobilisering af modificerede nanopartikler og små molekyler til label-fri chip-baserede interaktion og kinetiske undersøgelser. Immobiliseringen protokol kan udføres på få minutter kræver <10 uM koncentration af små molekyler ligander. Ved at modulere ligand koncentration og kontakttid immobiliseringstrin tætheder kan nøje kontrolleres. Vore data viser, at on-chip bioorthogonal reaktioner bevare muligheden for in situ-funktiona…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender midler fra NIH (NHLBI kontrakt nr. HHSN268201000044C til RW, SH og SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
