Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaksjon på reversibelt Immobilize små molekyler eller flerkomponent Profiler for Biosensor Applications
Summary
Vi presenterer en fremgangsmåte for hurtig, reversible immobiliseringen av små molekyler og funksjonnanopartikkel sammensetninger for overflate-plasmonresonans (SPR) undersøkelser, ved hjelp av sekvensiell on-chip bioorthogonal cycloaddition kjemi og antistoff-antigen fangst.
Abstract
Metoder for rask overflate immobilisering av bioaktive små molekyler med kontroll over retningen og immobilisering tetthet er svært ønskelig for biosensor og microarray-applikasjoner. I denne studien bruker vi en svært effektiv kovalent bioorthogonal [4 2] cycloaddition reaksjon mellom trans-cyclooctene (TCO) og 1,2,4,5-tetrazine (TZ) for å aktivere microfluidic immobilisering av TCO / Tz-derivatized molekyler . Vi overvåke prosessen i sanntid i henhold til kontinuerlige strømningsbetingelser ved å bruke overflate-plasmonresonans (SPR). For å muliggjøre reversibel immobilisering og forlenge forsøksområdet til sensoroverflaten, vi kombinerer en ikke-kovalent antigen-antistoff-fangst komponent med cycloaddition reaksjonen. Ved vekselvis å presentere TCO eller Tz rester til sensoroverflaten, flere fangst-cykloaddisjon prosesser er det nå mulig på en sensorflaten for on-chip monterings-og interaksjons studier av en rekke flerkomponent-strukturer. Vi illustrate denne metoden med to forskjellige immobilisering eksperimenter på en biosensor chip, et lite molekyl, AP1497 som binder FK506-bindende protein 12 (FKBP12), og den samme lille molekyl som en del av en immobilisert, og in situ-funksjonalisert nanopartiklene.
Introduction
Effektiv konjugeringsreaksjoner er verdifulle verktøy for å feste bioaktive molekyler til overflater for en rekke av bioteknologi. Nylig har meget rask bioorthogonal [4 2] cycloaddition reaksjon mellom trans-cyclooctene (TCO) og 1,2,4,5-tetrazine (TZ) blitt brukt til å merke celleoverflater, subcellulære strukturer, antistoffer og nanopartikler en. – 7 Her bruker vi [4 +2] cycloaddition reaksjon i kombinasjon med antigen / antistoff fangst (GST / anti-GST) for reversibel on-chip syntese av flerkomponent strukturer for Surface Plasmon Resonans (SPR) interaksjonsanalyse og overvåke Prosessen i sanntid (figur 1). 8,9 Spesielt muliggjør fangst-cycloaddition strategi overflate regenerering ved hjelp av en etablert protokoll. 8. Som følge av monteringen av stabile sensoroverflater med kontroll over ligand retning og tettheten for forskjellige nye assay formatene er nå mulig. Brukedenne strategien vi demonstrere immobilisering av TCO / Tz-derivatized små molekyler og karakterisere cycloaddition priser i en rekke bufferbetingelser. Vi valgte velkjente interaksjon mellom FKBP12 og et molekyl som binder AP1497 FKBP12 10-12 som et eksempel for å verifisere at fangst-cycloaddition strategi bevarer evnen av den lille molekylet for å interagere med dens target når enten direkte festet til immobilisert GST antigen eller til immobilisert nanopartikler (NPS).
Denne metoden gir flere fordeler. For det første er det nå mulig den reversible immobiliseringen av små molekyler på sensorbrikker. Sekund, TCO / Tz immobilisering av små molekyler kan også label-free interaksjonsstudier som reverserer retningen på kanoniske SPR studier, og kan gi en utfyllende visning av en forpliktende samhandling. For det tredje gir denne metoden microfluidic syntese av målrettede nanopartikler, og øyeblikkelig vurdering av deres binding egenskaper. Dette lover å forbedre effektiviteten av å evaluere eller screening målrettede nanopartikler, og også redusere mengden av nanopartikler som kreves. 13-15 Fjerde, kan denne tilnærmingen måle reaksjonskinetikken bioorthogonal cycloaddition reaksjoner i sanntid under kontinuerlig flyt. Endelig er den TCO / Tz immobilisering kjemi robust i nærvær av serum. Til sammen forventer vi at denne allsidige tilnærming vil grovt rette for bygging av stabile sensoroverflater for et bredt utvalg av microfluidic studier med relevans til in vitro og in vivo cellulære applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fangst-cycloaddition metoden beskrevet her muliggjør rask, reversibel immobilisering av modifiserte nanopartikler og små molekyler for label-fri chip-basert samhandling og kinetiske studier. Immobiliseringen protokollen kan utføres på få minutter som krever <10 uM konsentrasjon av små-molekyl ligander. Ved modulering av ligandkonsentrasjon og kontakttid immobilisering tettheter kan reguleres nøye. Våre data viser at on-chip bioorthogonal reaksjoner bevare muligheten for in situ functionalized nanopar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner midler fra NIH (NHLBI kontrakt nummer HHSN268201000044C til RW, SH og SYS).
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
