प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं (एमबीसी-पी) और बायोफिल्म कोशिकाओं (एमबीसी-बी) के लिए एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की न्यूनतम जीवाणु एकाग्रता की स्थापना
Summary
यह प्रोटोकॉल एक बैक्टीरियल तनाव के लिए प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म प्रतिरोध के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है जो 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करके विट्रो में बायोफिल्म बना सकता है। प्लैंक्टोनिक या बायोफिल्म बैक्टीरिया पसंद के एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के धारावाहिक कमजोर पड़ने के संपर्क में हैं। अगर प्लेटों पर विकास से व्यवहार्यता को आसकित किया जाता है।
Abstract
यह प्रोटोकॉल एक बैक्टीरियल तनाव के लिए प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म प्रतिरोध के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है जो विट्रो मेंबायोफिल्म बना सकता है। बैक्टीरिया एक ९६ अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में टीका लगाया जाता है । प्लैंकटोनिक परख के मामले में, पसंद के एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के सीरियल कमजोर पड़ने बैक्टीरियल निलंबन में जोड़े जाते हैं। बायोफिल्म परख में, एक बार टीका लगाने के बाद, बैक्टीरिया को एक निर्धारित अवधि में बायोफिल्म बनाने के लिए छोड़ दिया जाता है। असंबद्ध कोशिकाओं को कुओं से हटा दिया जाता है, मीडिया को मंगाया जाता है और पसंद के रोगाणुरोधी एजेंट के धारावाहिक कमजोर पड़ने को जोड़ा जाता है। रोगाणुरोधी एजेंट के संपर्क में आने के बाद, प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को विकास के लिए परख दिया जाता है। बायोफिल्म परख के लिए मीडिया को फ्रेश किया जाता है फ्रेश मीडिया में एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की कमी होती है और बायोफिल्म सेल्स को ठीक होने के लिए छोड़ दिया जाता है । वसूली अवधि के बाद बायोफिल्म सेल व्यवहार्यता को आसकित किया जाता है। एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के लिए एमबीसी-पी को दवा की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जो प्लैंक्टोनिक संस्कृति में कोशिकाओं को मारता है। इसके विपरीत, एक तनाव के लिए एमबीसी-बी 24 घंटे के लिए एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की सांद्रता बढ़ाने के लिए प्रीफेड बायोफिल्म्स को उजागर करके निर्धारित किया जाता है। एमबीसी-बी को एंटीमाइक्रोबियल एजेंट की सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जो बायोफिल्म में कोशिकाओं को मारता है।
Introduction
एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख शुरू में बैक्टीरिया की प्लैंक्टोनिक (मुक्त तैराकी) संस्कृतियों के प्रतिरोध परख करने के लिए विकसित किए गए थे। चूंकि कई जीवाणु संक्रमणों में बायोफिल्म (सतह से जुड़ी कोशिकाएं) शामिल हैं, इसलिए हम बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध को परखने के लिए एक विधि विकसित करने में रुचि रखते थे। हालांकि, अधिकांश एंटीबायोटिक प्रतिरोध परख बायोफिल्म्स के प्रतिरोध को मापने के लिए खराब अनुकूल हैं। उदाहरण के लिए, न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) का निर्धारण प्लैंक्टोनिक बैक्टीरियल संस्कृतियों के एंटीबायोटिक प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए स्वर्ण मानक है 1। इस परख एंटीबायोटिक की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ एक पतला प्लैंक्टोनिक संस्कृति मिश्रण जरूरत पर जोर देता है । एंटीबायोटिक की एकाग्रता जो प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के दृश्य विकास को रोकती है, एमआईसी है। चूंकि यह परख विकास के अवरोध पर निर्भर करती है, परिभाषा के अनुसार, यह बायोफिल्म संस्कृतियों के साथ काम नहीं कर सकती, जिसके लिए एक पूर्वउड़ान बायोफिल्म में कोशिकाओं की एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की जांच की आवश्यकता होती है। विकास अवरोध को मापने के बजाय, यहां वर्णित एमबीसी-बी परख एंटीबायोटिक की एकाग्रता निर्धारित करती है जो पहले से ही बायोफिल्म में मौजूद कोशिकाओं को मारता है । इस प्रकार, इस परख का उद्देश्य स्थापित बायोफिल्म संक्रमणों के एंटीबायोटिक उपचारों की नकल करना है, और वीवो मेंबैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अधिक प्रासंगिक दृश्य प्रदान करना है।
चूंकि बायोफिल्म आम तौर पर प्लैंक्टोनिक संस्कृतियों 2-4 की तुलना में अधिक एंटीबायोटिक प्रतिरोधी होते हैं, इसलिए एक विधि ईजाद करना आवश्यक था जो सीधे बायोफिल्म के एंटीबायोटिक प्रतिरोध को प्लैंक्टोनिक संस्कृति से संबंधित करता है। इस प्रकार इस विधि का एक और लक्ष्य प्लैंक्टोनिक और बायोफिल्म कोशिकाओं के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के स्तर की तुलना करने में सीधे सक्षम होना है। एमबीसी-पी और एमबीसी-बी का वर्णन यह संभव है क्योंकि कोशिकाओं को इसी तरह की परिस्थितियों में सुसंस्कृत कर रहे हैं । हमने बायोफिल्म-विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध 5-8 के लिए महत्वपूर्ण कई जीनों का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लैंकटोनिक कोशिकाओं में एंटीबायोटिक प्रतिरोध कोशिकाओं (जैसे उत्परिवर्तन) में स्थायी परिवर्तन के कारण एंटीबायोटिक की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) में वृद्धि के रूप में परिभाषितकिया गया ह…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि के साथ संपादकीय मदद के लिए ली झांग, जियान-झी ली, हारून हिंज और क्लेटन हॉल का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस परख शुरू में जॉर्ज ओ ‘ Toole, डार्टमाउथ में गीसेल स्कूल ऑफ मेडिसिन की प्रयोगशाला में विकसित किया गया था । डॉ माह की प्रयोगशाला में अनुसंधान कनाडा और सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
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1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
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KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
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K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
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(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
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Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
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Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
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Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
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96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
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Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
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Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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