플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립
Summary
이 프로토콜은 96웰 마이크로티터 플레이트를 사용하여 체외에서 생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉 과 생물막 내성을 직접 비교할 수 있게 한다. 플랑크토닉 또는 생물막 박테리아는 선택의 항균제의 직렬 희석에 노출된다. 생존력은 한천 판의 성장에 의해 분석됩니다.
Abstract
이 프로토콜은 시험관 내에서생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉과 생물막 저항을 직접 비교할 수 있게 한다. 박테리아는 96 웰 마이크로티터 플레이트의 우물에 접종됩니다. 판자 분석의 경우, 선택의 항균제의 직렬 희석이 세균 현탁액에 첨가된다. 생물막 분석에서, 한 번 접종, 박테리아는 시간의 설정 된 기간 동안 생물 막을 형성하기 위해 남아있다. 부착되지 않은 세포는 우물에서 제거되고, 미디어는 보충되고 선택의 항균제의 직렬 희석이 첨가된다. 항균제에 노출된 후, 판자 세포는 성장을 위해 분석된다. 생물막 분석의 경우, 매체는 항균제가 결여된 신선한 매체로 리프레시되고 생물막 세포는 회복상태로 남겨집니다. 생물막 세포 생존가능성은 회복 기간 이후에 분석된다. 항균제에 대한 MBC-P는 판자 배양에서 세포를 죽이는 약물의 가장 낮은 농도로 정의된다. 반면, MBC-B는 24시간 동안 항균제의 농도를 높이기 위해 미리 형성된 생물막을 노출시킴으로써 결정된다. MBC-B는 생물막내세포를 죽이는 항균제의 가장 낮은 농도로 정의된다.
Introduction
항생 저항 분석은 처음에 박테리아의 판자 (자유 수영) 문화의 저항을 분석하기 위하여 개발되었습니다. 많은 세균성 감염은 생물막 (표면 부착 된 세포)를 포함하기 때문에, 우리는 생물막 특정 항생제 내성을 분석하는 방법을 개발하는 데 관심이 있었다. 그러나, 대부분의 항생 저항 분석은 생물막의 저항을 측정하기 위해 제대로 적합합니다. 예를 들어, 최소한의 억제 농도(MIC)를 결정하는 것은 판자 세균 배양1의항생제 내성을 결정하기 위한 금본위제이다. 이 분석은 희석 된 판자 문화를 항생제의 희석 시리즈와 혼합하는 것을 수반합니다. 판자 세포의 눈에 보이는 성장을 억제하는 항생제의 농도는 MIC입니다. 이 분석법은 성장 억제에 의존하기 때문에, 정의에 의해, 그것은 미리 자란 생물막에서 세포의 항생제 감도를 검사해야 하는 생물막 배양과 함께 작동할 수 없습니다. 여기에 설명된 MBC-B 분석법은 성장 억제를 측정하는 대신 생물막에 이미 존재하는 세포를 죽이는 항생제의 농도를 결정합니다. 따라서, 이러한 분석법은 확립된 생물막 감염의 항생제 치료를 모방하고 생체 내에서세균성 항생제 내성의 보다 관련성이 있는 관점을 제공하는 것을 목표로 한다.
생물막은 일반적으로 판자 배양보다 항생제 내성이 2-4이기 때문에, 생물막의 항생제 내성을 직접 적으로 플랑크토닉 배양의 항생제 내성을 포함하는 방법을 고안할 필요가 있었다. 따라서 이 방법의 또 다른 목표는 판자 세포와 생물막 세포 사이의 항생 저항 수준을 직접 비교할 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 MBC-P와 MBC-B 의 소는 세포가 비슷한 조건에서 배양되기 때문에 이를 가능하게 합니다. 우리는 생물막 특이적 항생제 저항 5-8에 중요한 몇몇 유전자를 연구하기 위하여 이 방법을 이용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
판자 세포내 항생 저항성은 세포의 영구적인변화(예를 들어 돌연변이)로 인한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)의 증가로 정의된다. 현재까지 확인된 생물막 특이적 저항 또는 내성의 메커니즘은 생물막 내의 야생 형 유전자의 발현의 결과입니다. 따라서, 저항의 고전적인 정의는 생물막에 적용되지 않습니다. 그러나, 정의의 또 다른 세트가 제시되었습니다: 저항 기계장치는 항생제가 그것의 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 원고에 대한 편집 적 도움을 리 장, 시안 지 리, 아론 힌츠, 클레이튼 홀에게 감사드립니다. 이 분석은 처음에 조지 O’Toole의 실험실에서 개발되었다, 다트머스에서 의학의 가이젤 학교. Mah 박사의 실험실에 있는 연구는 캐나다와 낭포성 섬유증 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 보조금에 의해 지원됩니다.
Materials
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1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
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KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
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K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
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(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
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Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
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Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
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Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
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96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
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Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
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Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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