Établissement de la concentration bactéricide minimale d’un agent antimicrobien pour les cellules planctoniques (MBC-P) et les cellules de biofilm (MBC-B)

Summary

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro à l’aide d’une plaque de microtitre de 96 puits. Les bactéries planctoniques ou biofilms sont exposées à des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix. La viabilité est dosée par croissance sur des plaques de gélose.

Abstract

Ce protocole permet une comparaison directe entre la résistance planctonique et la résistance au biofilm pour une souche bactérienne qui peut former un biofilm in vitro. Les bactéries sont inoculées dans les puits d’une plaque de microtitre de 96 puits. Dans le cas du test planctonique, des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées aux suspensions bactériennes. Dans le test du biofilm, une fois inoculées, les bactéries sont laissées pour former un biofilm sur une période de temps définie. Les cellules non attachées sont retirées des puits, le milieu est reconstitué et des dilutions en série de l’agent antimicrobien de choix sont ajoutées. Après l’exposition à l’agent antimicrobien, les cellules planctoniques sont analysées pour la croissance. Pour le dosage du biofilm, le milieu est rafraîchi avec des milieux frais dépourvus de l’agent antimicrobien et les cellules du biofilm sont laissées à récupérer. La viabilité des cellules du biofilm est analysée après la période de récupération. Le MBC-P pour l’agent antimicrobien est défini comme la plus faible concentration de médicament qui tue les cellules dans la culture planctonique.  En revanche, le MBC-B d’une souche est déterminé en exposant des biofilms préformés à des concentrations croissantes d’agent antimicrobien pendant 24 heures. Le MBC-B est défini comme la plus faible concentration d’agent antimicrobien qui tue les cellules du biofilm.

Introduction

Des tests de résistance aux antibiotiques ont été initialement développés pour tester la résistance des cultures planctoniques (nageant librement) de bactéries. Étant donné que de nombreuses infections bactériennes impliquent des biofilms (cellules attachées en surface), nous étions intéressés à développer une méthode pour analyser la résistance aux antibiotiques spécifique au biofilm. Cependant, la plupart des tests de résistance aux antibiotiques sont mal adaptés pour mesurer la résistance des biofilms. Par exemple, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la norme de référence pour déterminer la résistance aux antibiotiques des cultures bactériennes planctoniques ¹. Ce dosage consiste à mélanger une culture planctonique diluée avec une série de dilutions d’antibiotiques.  La concentration d’antibiotique qui inhibe la croissance visible des cellules planctoniques est le MIC. Étant donné que ce test repose sur l’inhibition de la croissance, par définition, il ne peut pas fonctionner avec des cultures de biofilm, ce qui nécessite d’examiner la sensibilité aux antibiotiques des cellules d’un biofilm précroissé. Au lieu de mesurer l’inhibition de la croissance, le test MBC-B décrit ici détermine la concentration d’antibiotique qui tue les cellules déjà existantes dans un biofilm. Ainsi, ce test vise à imiter les traitements antibiotiques des infections à biofilm établies, et à fournir une vue plus pertinente de la résistance bactérienne aux antibiotiques in vivo.

Étant donné que les biofilms sont généralement plus résistants aux antibiotiques que les cultures planctoniques ^2-4, il a été nécessaire de concevoir une méthode qui relie directement la résistance aux antibiotiques d’un biofilm à celle d’une culture planctonique. Ainsi, un autre objectif de cette méthode est de pouvoir comparer directement le niveau de résistance aux antibiotiques entre les cellules planctoniques et biofilm. Les essais MBC-P et MBC-B décrits ici rendent cela possible parce que les cellules sont cultivées dans des conditions similaires. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier plusieurs gènes qui sont importants pour la résistance aux antibiotiques spécifiques au biofilm ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B Cultiver un biofilm (adapté de O’Toole9). Cultiver une culture de la souche d’intérêt de type sauvage et de la souche mutante pendant 16 heures dans un milieu riche à 37 °C. Diluer les cultures saturées pendant la nuit 1:100 en milieu frais pour les tests de résistance aux antibiotiques. Un milieu standard pour P. aeruginosa est le milieu minimal M63 complété par du sulfate de magnésium et de l’arginine (voir <s…

Representative Results

Des essais MBC-P et MBC-B ont été effectués, comparant la sensibilité du type sauvage PA14 avec PA14 ∆ndvB. La tobramycine a été utilisée comme antibiotique. Les résultats correspondant à l’étape 1.4.4(figure 1)et à l’étape 2.3.4(figure 2)sont présentés. PA14 et ∆ndvB ont été inoculés dans les essais MBC-P et MBC-B en triple exemplaire. Après avoir terminé les étapes 1.0-1.4 du protocole MBC-B et les étapes 2.0-2.3 du protocole MBC-P, les ce…

Discussion

La résistance aux antibiotiques dans les cellules planctoniques est définie comme une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique due à un changement permanent dans les cellules(par exemple, une mutation). Les mécanismes de résistance ou de tolérance spécifiques au biofilm qui ont été identifiés à ce jour sont le résultat de l’expression de gènes de type sauvage dans les biofilms. Ainsi, la définition classique de la résistance ne s’applique pas aux biofilms…

Materials

1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate