Upprättande av minimal bakteriedödande koncentration av ett antimikrobiellt medel för planktoniska celler (MBC-P) och biofilmceller (MBC-B)

Summary

Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsbeständighet för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro med en 96-brunns mikrotiterplatta. Planktoniska bakterier eller biofilmsbakterier utsätts för seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet. Livskraft analyseras genom tillväxt på agarplattor.

Abstract

Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsresistens för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro. Bakterier vaccinerar sig i brunnarna på en 96-brunns mikrotiterplatta. När det gäller planktonisk analys tillsätts seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet till bakteriella suspensioner. I biofilmstestet, när de väl har vaccinelats, lämnas bakterierna att bilda en biofilm under en viss tidsperiod. Obundna celler avlägsnas från brunnarna, mediet fylls på och seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet läggs till. Efter exponering för det antimikrobiella medlet analyseras planktoniska celler för tillväxt. För biofilmsanalysen uppdateras mediet med färska medier som saknar det antimikrobiella medlet och biofilmscellerna lämnas att återhämta sig. Biofilmcellens livskraft analyseras efter återhämtningsperioden. MBC-P för det antimikrobiella medlet definieras som den lägsta koncentrationen av läkemedel som dödar cellerna i planktoniska kulturen.  Däremot bestäms MBC-B för en stam genom att exponera förformade biofilmer för ökande koncentrationer av antimikrobiellt medel i 24 timmar. MBC-B definieras som den lägsta koncentrationen av antimikrobiellt medel som dödar cellerna i biofilmen.

Introduction

Antibiotikaresistens analyser utvecklades ursprungligen för att analysera resistens av planktoniska (fri simning) kulturer av bakterier. Eftersom många bakteriella infektioner involverar biofilmer (ytanslutna celler) var vi intresserade av att utveckla en metod för att analysera biofilmsspecifik antibiotikaresistens. De flesta antibiotikaresistensanalyser är dock dåligt lämpade för att mäta biofilmsresistens. Att till exempel bestämma den minimala hämmande koncentrationen (MIC) är guldstandarden för bestämning av antibiotikaresistens hos planktoniska bakteriekulturer ¹. Denna analys innebär att blanda en utspädd planktonisk kultur med en utspädningsserie av antibiotika.  Koncentrationen av antibiotika som hämmar den synliga tillväxten av planktoniska celler är MIC. Eftersom denna analys förlitar sig på hämning av tillväxt, kan den per definition inte fungera med biofilmkulturer, vilket kräver att man undersöker cellernas antibiotikakänslighet i en pregrown biofilm. I stället för att mäta tillväxthämning bestämmer MBC-B-analysen som beskrivs här koncentrationen av antibiotika som dödar celler som redan finns i en biofilm. Således syftar denna analys till att efterlikna antibiotikabehandlingar av etablerade biofilminfektioner och ge en mer relevant bild av bakteriell antibiotikaresistens in vivo.

Eftersom biofilmer i allmänhet är mer antibiotikaresistenta än planktoniska ^{kulturer 2-4} , var det nödvändigt att utforma en metod som direkt relaterar antibiotikaresistensen hos en biofilm till en planktonisk kultur. Ett annat mål med denna metod är således att direkt kunna jämföra nivån av antibiotikaresistens mellan planktoniska och biofilmsceller. MBC-P och MBC-B analyser som beskrivs här gör detta möjligt eftersom celler odlas under liknande förhållanden. Vi har använt denna metod för att studera flera gener som är viktiga för biofilmsspecifik antibiotikaresistens ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B Odla en biofilm (anpassad från O’Toole9). Odla en kultur av den vilda typen av intresse och mutantstam i 16 timmar i ett rikt medium vid 37 °C. Späd ut de mättade nattkulturerna 1:100 till färskt medium för antibiotikaresistensanalyser. Ett standardmedium för P. aeruginosa är M63 minimalt medium kompletterat med magnesiumsulfat och arginin (se tabell 1). Detta medium stimulerar bildandet av en mer robus…

Representative Results

MBC-P- och MBC-B-analyser utfördes och jämförde känsligheten hos PA14 vildtyp med PA14 ∆ndvB. Tobramycin användes som antibiotika. Resultat motsvarande steg 1.4.4(figur 1)och steg 2.3.4(figur 2)presenteras. PA14 och ∆ndvB inokulerades i MBC-P och MBC-B analyser i tre exemplar. Efter att ha slutfört steg 1.0-1.4 i MBC-B-protokollet och steg 2.0-2.3 i MBC-P-protokollet, pläterades de livskraftiga cellerna på en LB agar-platta. Koncentrationer av tobramycin<spa…

Discussion

Antibiotikaresistens i planktoniska celler definieras som en ökning av den minsta hämmande koncentrationen (MIC) av ett antibiotikum på grund av en permanent förändring i cellerna(t.ex. en mutation). De mekanismer för biofilmsspecifik resistens eller tolerans som hittills har identifierats är resultatet av uttrycket av vilda gener inom biofilmer. Således gäller den klassiska definitionen av resistens inte biofilmer. En annan uppsättning definitioner har dock presenterats: resistensmekanismer hindrar an…

Materials

1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate