Sistematik Analizi<em> In Vitro</emÇok-çukurlu plaka mikroakışkan Sistemi ile> Hücre Rolling
Summary
Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunmaktadır.
Abstract
Hücre bazlı tedavisi için önemli bir sorun, sistemik damar içine veya intra-arteryel infüzyonla, aşağıdaki ilgi dokularına yüksek verim ile yaşayabilir hücrelerin büyük bir miktarda hedef yetersizliğidir. Sonuç olarak, hücre homing artan anda hücre tedavisini geliştirmek için bir strateji olarak incelenmiştir. Vasküler endotel yuvarlanan hücre hücre hedeflemesi sürecinde önemli bir adımdır ve bir paralel plaka akış odası (PPFC) kullanılarak in-vitro olarak tanınacak. Ancak bu zayıf kontrol edilen akış koşulları, son derece can sıkıcı, düşük akış tahlilidir. Bunun yerine, tam olarak kontrol edilen, fizyolojik olarak ilgili kesme akışı altında 1,2 daha yüksek bir verim içinde hücresel yuvarlanma özellikleri çalışma sağlayan bir çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Bu yazıda, P-ve E-selectin kaplı yüzeylerde hem de hücre tek-kaplı yüzeylerde HL-60 (insan promiyelositik lösemi) hücrelerinin yuvarlanma özelliklerini readil olabilir göstermeky incelenmiştir. Daha iltihaplı koşulların simüle edilmesi için, mikroakışkan kanal yüzeyi daha sonra önemli ölçüde dinamik koşullar altında HL-60 hücreleri ile etkileşimleri, artan tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile aktive edilmiş endotel hücreleri (EC) ile kaplandı. Geliştirilmiş verimlilik ve bu hızları haddeleme ve yolunu haddeleme gibi parametrelerin hızlı analizi izin verir entegre çoklu parametre yazılımı analizi platformu, in-vitro hücre haddeleme özelliklerini değerlendirmek için önemli bir avantaj oluşturmaktadır. Hücre haddeleme ve homing darbe için tasarlanmış mühendislik yaklaşımları, hızlı ve doğru analiz sağlayan, bu platform önceden eksojen hücre tabanlı tedavi yardımcı olabilir.
Introduction
Hücre tabanlı tedavinin başarılı klinik çeviride önemli zorluklardan biri verimsiz dağıtım veya arzu sitelere 3,4 sistemik aşılanmış hücrelerin hedef olduğunu. Sonuç olarak, hücre homing geliştirmek için yaklaşımlar için bir arayışlar sürmektedir, ve özellikle de, hücre terapisi geliştirmek için bir strateji olarak, haddeleme hücre. Kan damarları üzerinde yuvarlanan Cep klasik hastalık sitelerine 5 alınsın lökositler için tanımlanan hücre homing kaskad, önemli bir adımdır. Bu adım, endotel selektinler arasındaki spesifik etkileşimlere tarafından yönetilir örneğin, P-selektin ve E-(P-ve E-sel) ve lökositlerin 5,6 yüzeyinde kontra ligandları. Daha iyi anlaşılması ve hücre hedeflemesi geliştirilmiş verimlilik ve özellikle haddeleme adım, hücre tabanlı tedavi geliştirmek için yeni platformlar için arayış içinde büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar bu iki düz plat oluşan, paralel plaka akış odaları (PPFCs) kullanılarak elde edilmiştirBir hücre süspansiyonu bir şırınga 7,8, 9, pompa kullanılarak perfüze, üzerinden, üst plaka üzerinde yer alan bir giriş ve çıkış bağlantı noktası ile aralarında bir conta ile es. Taban levhasının yüzeyi bir ilgili hücre tek tabaka / alt-tabakalar kaplanabilir ve kesme akımı altında perfüze hücreleri ve yüzey arasındaki etkileşimi, daha sonra 7 araştırılmıştır. Ancak, PPFC kabarcık oluşumu, sızıntı ve büyük sakıncalar sergilemesi kötü kontrollü akışı ile düşük verim, reaktif tüketim, ve oldukça sıkıcı bir yöntemdir.
Geleneksel PPFC için alternatif bir teknik, düşük reaktif tüketimi 1,10 ile, doğru, bilgisayar kontrollü kesme akımı altında hücresel tahlillerde daha yüksek verim performansı (PPFCs en fazla 10 kat daha yüksek) izin, bir çok-yuvalı plaka mikroakışkan sistemidir. Hücre deneyleri haddeleme USI hücre mono tabakaları veya oluşturulmuş bir alt-tabakalar ile kaplanır ve görüntülü edilebilir, mikroakışkan kanal içinde yapılmaktadırng haddeleme özelliklere sahip bir mikroskop, hali hazırda, uygun bir yazılım kullanılarak analiz edildi. Bu çalışmada, insan promiyelositik lösemi farklı yüzeylerde (HL-60) hücreleri yuvarlanma özelliklerini inceleyerek bu çok-çukurlu plaka mikroakışkan sisteminin yeteneklerini gösterir. HL-60 P-ve E-sel, hem de farklı haddeleme reseptörleri ifade eden hücre tekli katmanları üzerinde, analiz edilmiştir gibi alt-tabakalar üzerinde yuvarlanan. Buna ek olarak, antikor (Ab), bu yüzeyler üzerinde HL-60 yuvarlanma hareketine aracılık özel selektinler doğrudan katılımını göstermek için kullanılmıştır engelleme. Yuvarlanan deneyleri, hız haddeleme, haddeleme hücre sayısı ve haddeleme yolu özellikleri gibi kilit dönme parametrelerini etkin analizi sağlayan, minimal reaktif / hücre tüketimi, kararlı kesme akışı altında, yüksek verim ile yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksojen hücre tabanlı tedavi başarılı çevirisinde önemli zorluklardan biri verimli, yüksek verimlilik engraftmınt 3 ile yaralanma ve inflamasyon sitelere hücreleri sunmak için yetersizliğidir. Hücre haddeleme sonunda dokuya 5 içine endotel yoluyla sağlam yapışması ve göçü yol açan, kan damarlarının duvarlarında hücrelerin yavaşlama kolaylaştıran, hücre homing sürecinde kritik bir adım teşkil etmektedir. Aday hücre tipleri için haddeleme işlemi daha iyi anlaşılm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CHO-P hücreleri Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi, Harvard Tıp Okulu) bir tür hediye edildi. Bu çalışma JMK Bu çalışma aynı zamanda JMK bir Movember-Prostat Kanseri Vakfı Yarışması Ödülü tarafından kısmen desteklenen Sağlık hibe HL095722 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
