Analyse systématique des<em> In Vitro</em> Cellule de roulement en utilisant un système microfluidique plaque multi-puits
Summary
Cette étude a utilisé un système microfluidique plaque multi-puits, ce qui augmente considérablement le débit des études de roulement de cellule sous flux de cisaillement physiologiquement pertinents. Compte tenu de l'importance de laminage de cellules dans la cellule multi-homing étape cascade et l'importance de la prise d'origine cellulaire après une délivrance systémique de populations de cellules exogènes chez les patients, ce système présente un potentiel en tant que plate-forme de criblage pour améliorer la thérapie à base de cellules.
Abstract
Un défi majeur pour la thérapie à base de cellules est l'incapacité à cibler systématiquement une grande quantité de cellules viables avec une grande efficacité pour les tissus d'intérêt après la perfusion intraveineuse ou intra-artérielle. Par conséquent, l'augmentation de la prise d'origine cellulaire est actuellement étudiée comme une stratégie pour améliorer la thérapie cellulaire. Cellule roulant sur l'endothélium vasculaire est une étape importante dans le processus de prise d'origine cellulaire et peut être sondé in vitro en utilisant une chambre d'écoulement à plaques parallèles (PPFC). Cependant, il s'agit d'un essai de débit extrêmement fastidieuse, bas, avec des conditions d'écoulement mal contrôlées. Au lieu de cela, nous avons utilisé un système microfluidique plaque multi-puits qui permet l'étude des propriétés de roulement cellulaire dans un débit plus élevé dans des conditions contrôlées précisément, les flux de cisaillement physiologiquement pertinents 1,2. Dans cet article, nous montrons comment les propriétés de roulement de HL-60 (leucémie promyélocytaire humaine) des cellules sur des surfaces E-sélectine-P-enduit et ainsi que sur les surfaces de monocouches-enrobées de cellules peuvent être readily examinée. Pour mieux simuler les conditions inflammatoires, la surface du canal microfluidique a été revêtu de cellules endothéliales (EC), qui ont ensuite été activés avec facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), ce qui augmente considérablement les interactions avec les cellules HL-60 dans des conditions dynamiques. Le débit amélioré et intégré multi-paramètre plate-forme d'analyse d'un logiciel, qui permet une analyse rapide des paramètres tels que la vitesse de laminage et de chemin de roulement, présente des avantages importants pour l'évaluation des propriétés de laminage de cellules in vitro. Permettant une analyse rapide et précise des approches d'ingénierie conçues pour influer sur roulement cellulaire et homing, cette plate-forme peut aider à la thérapie avance à base de cellules exogène.
Introduction
L'un des principaux défis dans la traduction clinique de succès de la thérapie à base de cellules est la livraison inefficace ou le ciblage des cellules systémique infusées aux sites désirés 3,4. Par conséquent, il ya une recherche constante des approches visant à améliorer la prise d'origine cellulaire, et plus particulièrement cellule de roulement, comme une stratégie pour améliorer la thérapie cellulaire. Cellule roulant sur les vaisseaux sanguins est une étape clé dans la cascade de ralliement de la cellule, classiquement défini pour les leucocytes qui sont recrutés à des sites de la maladie 5. Cette étape est gouvernée par des interactions spécifiques entre les sélectines endothéliales, c'est à dire P-sélectine E et leurs contre-ligands sur la surface de leucocytes 5,6 (P-et E-sel), et. Une meilleure compréhension et une meilleure efficacité de la prise d'origine cellulaire, et plus précisément l'étape de laminage, sont d'une grande importance dans la quête de nouvelles plates-formes pour améliorer la thérapie à base de cellules. À ce jour, cela a été réalisé à l'aide de chambres d'écoulement parallèles de la plaque (les PPFCs), comprenant deux plate plates avec un joint d'étanchéité entre eux, avec un orifice d'entrée et de sortie situés sur la plaque supérieure, à travers lequel une suspension cellulaire est perfusé à l'aide d'une pompe à seringue 7,8, 9. La surface de la plaque de fond peut être revêtue d'une monocouche de cellules / substrats pertinents et l'interaction entre les cellules perfusées et la surface sous écoulement de cisaillement est ensuite exploré 7. Cependant, PPFC est un débit faible, réactif consommant, et méthode assez fastidieuse, la formation de bulles, de fuite et de flux mal contrôlés présentant des inconvénients majeurs.
Une technique alternative pour la FPNC traditionnel est un système microfluidique plaque multi-puits, ce qui permet de meilleures performances de débit de dosages cellulaires (jusqu'à 10 fois plus élevé que PPFCs) sous précis, le flux de cisaillement contrôlé par ordinateur, avec une faible consommation de réactif de 1,10. Expériences cellule de laminage sont exécutées à l'intérieur des canaux microfluidiques, qui peut être revêtu avec des monocouches de cellules ou de substrats innovants et usi imagéeng d'un microscope, avec des propriétés de roulement facilement analysée en utilisant un logiciel approprié. Dans cette étude, nous démontrons les capacités de ce système microfluidique plaque multi-puits par l'étude des propriétés de roulement de leucémie promyélocytaire humaine (HL-60) cellules sur différentes surfaces. HL-60 roulant sur des substrats tels que P-et E-sel, ainsi que sur des monocouches de cellules exprimant différents récepteurs de roulement, ont été analysées. En outre, un anticorps (Ab) de blocage a été utilisé pour démontrer l'implication directe des sélectines spécifiques dans la médiation du mouvement de roulement du HL-60 sur ces surfaces. Expériences de roulement ont été réalisées avec un débit accru, sous flux de cisaillement stable, avec un minimum de consommation du réactif / cellulaire, permettant une analyse efficace des paramètres de laminage clés tels que la vitesse de roulement, le nombre de cellules de roulement et roulement propriétés du chemin.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'un des principaux défis dans la traduction réussie de la thérapie à base de cellules exogène est l'incapacité de livrer efficacement les cellules à des sites de lésion et l'inflammation à haute efficacité greffe 3. Cellule de roulement représente une étape cruciale dans le processus de prise d'origine cellulaire, facilitant la décélération de cellules sur les parois des vaisseaux sanguins, conduisant finalement à leur adhésion ferme et la transmigration à travers l'endo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellules CHO-P étaient une sorte de cadeau du Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé HL095722 de subvention à JMK Ce travail a également été soutenue en partie par une Fondation du cancer du Challenge Award Movember prostatique à JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
