Systematische Analyse von<em> In-vitro-</em> Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System
Summary
Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.
Abstract
Eine große Herausforderung für zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, systemisch Ziel, eine große Menge von lebensfähigen Zellen mit hoher Effizienz zu Geweben von Interesse nach intravenöser oder intraarterieller Infusion. Folglich erhöht Zelle Homing wird derzeit als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern sucht. Zell Rollen auf dem vaskulären Endothel ist ein wichtiger Schritt im Prozess der Zell Homing und kann in-vitro unter Verwendung eines Parallelplattenlaufkammer (PPFC) untersucht werden. Dies ist jedoch ein extrem mühsam, niedrige Durchsatz-Assay, mit schlecht eingestellten Strömungsbedingungen. Stattdessen haben wir eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, das Studium der Zellrolleigenschaften unter genau kontrollierten, physiologisch relevanten Scherströmung 1,2 ermöglicht einen höheren Durchsatz. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die Rolleigenschaften von HL-60 (menschliche Promyelozytenleukämie-Zellen) auf P-und E-Selectin beschichteten Oberflächen sowie auf Zellmonoschicht-beschichteten Oberflächen werden readily sucht. Um besser zu simulieren entzündlichen Bedingungen wurde die mikrofluidische Kanaloberfläche mit Endothelzellen (ECs), die dann mit Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) aktiviert wurden, signifikant erhöht Wechselwirkungen mit HL-60-Zellen unter dynamischen Bedingungen beschichtet. Die verbesserte Durchsatz und integrierter Multi-Parameter-Analyse-Software-Plattform, die eine schnelle Analyse von Parametern wie Walzgeschwindigkeiten und Rollbahn ermöglicht, sind wichtige Vorteile für die Beurteilung der Zellrollverhalten in-vitro. Die eine schnelle und genaue Analyse von technischen Konzepten, die auf Zell Walz-und Referenz auswirken, kann diese Plattform Voraus exogene zellbasierte Therapie helfen.
Introduction
Eine der großen Herausforderungen bei der erfolgreichen klinischen Übersetzung von Zell-basierten Therapie ist die ineffiziente Lieferung oder Targeting von systemisch infundiert Zellen an gewünschten Stellen 3,4. Folglich gibt es eine ständige Suche nach Ansätzen zur Zelle Homing zu verbessern, und zwar Zelle Rollen, als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern. Zellroll auf die Blutgefäße ist ein wichtiger Schritt in der Zelle Homing Kaskade, klassisch für Leukozyten, die zu Krankheit Stellen 5 rekrutiert werden, definiert. Dieser Schritt wird durch spezifische Interaktionen zwischen Endothelzellen Selektine geregelt, dh P-und E-Selektin (P-und E-sel) und ihre Gegenliganden auf der Oberfläche von Leukozyten 5,6. Ein besseres Verständnis und eine verbesserte Effizienz der Zell Homing und insbesondere der Walzschritt, sind von großer Bedeutung bei der Suche nach neuen Plattformen, um zellbasierte Therapie zu verbessern. Bisher ist dies durch die Verwendung parallel Platte Strömungskammern (PPFCs), bestehend aus zwei flachen Plattform erreichtes mit einer Dichtung dazwischen, mit einem Zulauf-und Ablauföffnung auf der oberen Platte angeordnet ist, durch welche eine Zellsuspension wird unter Verwendung einer Spritzenpumpe 7,8, 9 perfundiert. Die Oberfläche der Bodenplatte kann mit einer entsprechenden Zellmonolayer / Substrate beschichtet werden und die Interaktion zwischen Zellen durchblutet und der Oberfläche unter Scherströmung ist dann 7 erkundet. Allerdings ist PPFC ein niedriger Durchsatz, Reagenz aufwendig und ziemlich langweilig Methode, mit Blasenbildung, Leckage, und schlecht kontrollierten Fluss präsentiert große Nachteile.
Eine alternative Technik zur herkömmlichen PPFC ist ein Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, ermöglicht höhere Durchsatzleistung der zellulären Assays (bis zu 10 mal höher als PPFCs) unter genauer, computergesteuerten Scherströmung mit geringen Reagenzienverbrauch 1,10. Zellrollversuche sind in den mikrofluidischen Kanälen durchgeführt, die mit Zellmonoschichten oder gentechnisch Substrate beschichtet werden können und abgebildet using ein Mikroskop, mit Rolleigenschaften analysiert leicht mit einer geeigneten Software. In dieser Studie zeigen wir die Fähigkeiten dieser Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, indem man die Rolleigenschaften des menschlichen Promyelozyten-Leukämie (HL-60)-Zellen auf verschiedenen Oberflächen. HL-60 rollen auf Substraten wie P-und E-sel als auch auf Zellmonoschichten, die verschiedene Walz Rezeptoren analysiert. Zusätzlich Antikörper (Ab) wurde verwendet, um die Blockierung direkte Beteiligung von spezifischen Selectine bei der Vermittlung der Rollbewegung des HL-60 auf diesen Oberflächen zu demonstrieren. Roll Experimente wurden mit erhöhten Durchsatz unter stabilen Scherströmung durchgeführt wird, mit minimalen Reagenz / Zelle Verbrauch, die eine effiziente Analyse der wichtigsten Parameter wie Rollwalzgeschwindigkeit, die Anzahl der rollenden Zellen und Rollweg Eigenschaften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine der großen Herausforderungen in der erfolgreichen Übersetzung von exogenen zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, effizient liefern Zellen zu Websites von Verletzungen und Entzündungen, die mit hoher Effizienz engraftment 3. Zellroll stellt einen entscheidenden Schritt in den Prozess der Zell Homing, die Erleichterung der Verzögerung der Zellen an den Wänden der Blutgefäße, was schließlich zu ihrem festen Adhäsion und Trans durch das Endothel in das Gewebe 5 führt. Besseres Vers…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CHO-P-Zellen waren eine Art Geschenk von Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health HL095722 Zuschuss unterstützt, um JMK Diese Arbeit wurde zum Teil auch von einem Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award zu JMK unterstützt
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
