Systematisk analyse av<em> In Vitro</em> Cell Rolling Ved hjelp av en multi-brønn Plate Microfluidic System
Summary
Denne studie benyttet en multi-brønn-plate mikrofluidsystem, i betydelig grad å øke gjennomstrømningen av celle rullende studier henhold fysiologisk relevant skjærflyt. Gitt viktigheten av celle rulle i det flertrinns celle homing kaskade, og viktigheten av celle homing etter systemisk levering av eksogene populasjoner av celler hos pasienter, har dette systemet potensial som et screening-plattform for å forbedre celle-basert terapi.
Abstract
En hovedutfordring for celle-basert terapi er den manglende evne til systemisk rettet mot et stort antall av levedyktige celler med høy effektivitet til vev av interesse etter intravenøs eller intraarteriell infusjon. Følgelig øker celle homing er for tiden studert som en strategi for å forbedre celle terapi. Cell rulle på blodåreendotelets er et viktig skritt i prosessen med celle homing og kan bli analysert in-vitro ved hjelp av en parallell plate flyt kammer (PPFC). Men dette er en ekstremt kjedelig, lav gjennomstrømning analysen, med dårlig kontrollert strømningsforhold. I stedet har vi brukt et multi-brønn-plate mikrofluidsystem som muliggjør undersøkelse av cellulær valseegenskapene i en høyere gjennomstrømning henhold nøyaktig styrt, fysiologisk relevant skjærflyt 1,2. I denne artikkelen viser vi hvordan de rullende egenskapene til HL-60 (human promyelocytic leukemi) celler på P-og E-selektinantistoffer-belagte flater samt på cellemonolag-belagte overflater kan være readily undersøkt. For bedre å simulere inflammatoriske tilstander, ble mikrofluidkanal overflate belagt med endotelceller (ECS), som så ble aktivert med tumor nekrose faktor-α (TNF-α), i betydelig grad øker interaksjoner med HL-60-celler under dynamiske forhold. Den forbedrede gjennomstrømning og integrert multi-parameteranalyse software-plattform, som muliggjør hurtig analyse av parametere som for eksempel valsehastigheter og rullende bane, er viktige fordeler for å vurdere celle rullende egenskaper in vitro. Å tillate hurtig og nøyaktig analyse av tekniske tilnærminger er utformet for å påvirke celle rullende og homing, kan denne plattform hjelp forhånd eksogene cellebasert terapi.
Introduction
En av de store utfordringene i den vellykkede kliniske oversettelse av cellebasert terapi er ineffektiv levering eller målretting av systemisk tilført celler til ønskede områder 3,4. Det er derfor en konstant søken etter måter å forbedre celle homing, og spesielt celle rullende, som en strategi for å forbedre celle terapi. Cell rullende på blodårer er et viktig steg i cellen homing kaskade, klassisk definert for leukocytter som er rekruttert til sykdom nettsteder fem. Dette trinnet er regulert av spesifikke interaksjoner mellom endotelceller selektiner, det vil si P-og E-selectin (P-og E-sel), og deres mot-ligander på overflaten av leukocytter 5,6. Bedre forståelse og økt effektivitet av celle homing, og spesielt den rullende trinnet, er av stor betydning i jakten på nye plattformer for å forbedre celle-basert terapi. Hittil har dette blitt oppnådd ved hjelp av parallelle plate strømningskammere (PPFCs), omfattende to flate plates med en pakning mellom dem, med en innstrømning og utstrømning port plassert på den øvre plate, gjennom hvilken en cellesuspensjon blir perfusert ved hjelp av en sprøytepumpe 7,8, 9. Den overflate av bunnplaten belegges med et relevant cellemonolags / substrater og samspillet mellom perfusert celler og til overflaten under skjærstrøm blir deretter undersøkt 7.. Imidlertid er PPFC en lav gjennomstrømning, reagens-forbruk, og ganske kjedelige metoden, med bobledannelse, lekkasje og dårlig kontrollert strømnings presenterer store ulemper.
En alternativ teknikk til den tradisjonelle PPFC er en multi-brønn-plate mikrofluidsystem, som tillater høyere gjennomløp utførelse av cellulære analyser (opp til 10 ganger høyere enn PPFCs) i henhold til nøyaktig, datastyrt skjærflyt med lavt reagens forbruk 1,10. Cell rullende eksperimenter utføres inne i microfluidic kanaler, som kan være belagt med celle-monolag eller modifiserte substrater og avbildes USIng et mikroskop, med rullende egenskaper lett analyseres ved hjelp av en passende programvare. I denne studien, vi vise mulighetene dette multi-brønn plate microfluidic system ved å studere de rullende egenskaper av menneskelig promyelocytic leukemi (HL-60) celler på ulike overflater. HL-60 rullende på underlag som P-og E-sel, samt på celle-monolag som uttrykker forskjellige valse reseptorer, ble analysert. I tillegg er antistoffet (Ab) blokking ble anvendt for å demonstrere direkte involvering av spesifikke selektiner i mediering av den rullende bevegelse av HL-60 på disse overflater. Rullende eksperimenter ble utført med økt gjennomstrømning under stabil skjærflyt med minimal reagens / celle forbruk, slik at effektiv analyse av viktige rullende parametere som valsehastighet, antallet av rullende celler, og rullende baneegenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
En av de store utfordringene i vellykket oversettelse av eksogene cellebasert terapi er manglende evne til å effektivt levere cellene til områder av skader og betennelser med høy engraftment effektivitet tre. Cell rullende representerer et viktig skritt i prosessen med celle homing, legge til rette for nedbremsing av celler på veggene i blodårene, til slutt fører til firmaet sitt heft og sjelevandring gjennom endotelet i vevet fem. Bedre forståelse av valsingen for kandidat celletyper kan f?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CHO-P cellene var en slags gave fra Dr. Barbara Furie (Beth Israel Medical Center diakonale, Harvard Medical School). Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health tilskudd HL095722 til JMK Dette arbeidet ble også støttet delvis av en Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award til JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
