Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte
Summary
Des méthodes pour la manipulation et l'analyse des NF-kB-dépendante de l'hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l'étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d'autres contextes expérimentaux.
Abstract
L'hippocampe joue un rôle essentiel dans la formation et la consolidation de la mémoire épisodique, et dans l'orientation spatiale. Historiquement, l'hippocampe adulte a été considérée comme une région anatomique très statique du cerveau des mammifères. Cependant, des études récentes ont démontré que le gyrus denté de l'hippocampe est une zone de très grande plasticité chez les adultes, impliquant non seulement les modifications de circuits neuronaux existants, mais aussi la neurogenèse adulte. Cette plasticité est régulée par des réseaux complexes de transcription, dans lequel le facteur de transcription NF-kB joue un rôle de premier plan. Pour étudier et de manipuler la neurogenèse adulte, un modèle de souris transgénique pour l'inhibition neuronale spécifique du cerveau antérieur de l'activité de NF-kB peut être utilisé.
Dans cette étude, des méthodes sont décrites pour l'analyse de la neurogenèse NF-kB-dépendante, y compris ses aspects structuraux, et l'apoptose neuronale progénitrice, la prolifération et la signification cognitive, which a été spécifiquement évaluée par un gyrus denté (la DG) dépendant test de comportement, la répartition spatiale séparation Barnes labyrinthe (SPS-BM). Le protocole SPS-BM pourrait être simplement adaptée pour une utilisation avec d'autres modèles animaux transgéniques destinés à évaluer l'influence de certains gènes sur la neurogenèse hippocampique adulte. En outre, SPS-BM pourrait être utilisé dans d'autres contextes expérimentaux visant à étudier et manipuler l'apprentissage DG-dépendante, par exemple, l'utilisation d'agents pharmacologiques.
Introduction
Ontologiquement, l'hippocampe est l'une des plus anciennes structures cérébrales anatomiques connues. Il est responsable de diverses tâches complexes, telles que les fonctions pivots dans la régulation de la mémoire à long terme, l'orientation spatiale, et la formation et la consolidation de la mémoire respective. Anatomiquement, l'hippocampe est constitué de couches de cellules pyramidales (stratum pyramidale), y compris la corne d'Ammon (CA1, CA2, CA3 et CA4) régions et le gyrus denté (gyrus dentatus), qui contient des cellules granulaires et quelques progéniteurs neuronaux dans sa zone sous-granulaire . Les cellules granulaires projettent vers la région CA3 via les fibres moussues dits (axones des cellules granulaires).
Jusqu'à la fin du siècle dernier, le cerveau des mammifères adultes a été considéré comme un organe statique manque plasticité cellulaire et la neurogenèse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, un nombre croissant de preuves démontre clairement la neurogenèse adulte qui aura lieu dans au moinsdeux régions du cerveau, la zone sous-ventriculaire (SVZ) et la zone sous-granulaire de l'hippocampe.
Nos études antérieures, et ceux d'autres groupes, ont montré que le facteur de transcription NF-kB est un des régulateurs moléculaires essentiels de la neurogenèse adulte, et que ses résultats de-régulation dans de graves anomalies de l'hippocampe structurelles et des déficiences cognitives 1-6. NF-kB est le nom générique d'un facteur de transcription inductible composé de différentes combinaisons dimères de cinq sous-unités de liaison à l'ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, et p65 (RelA), les trois derniers qui ont des domaines de transactivation. Dans le cerveau, la forme la plus abondant trouvé dans le cytoplasme est un hétérodimère de p50 et p65, qui est maintenu sous une forme inactive par inhibiteur de kappa B (IkB)-protéines.
D'étudier et de manipuler directement la neurogenèse NF-kB-entraîné, nous utilisons des modèles de souris transgéniques pour permettre simples inhibition de tous les subun NF-kBson, en particulier dans le cerveau antérieur 7 (voir la figure 1). À cette fin, nous Croisé les lignées de souris transgéniques suivantes, IKB / – et -/tTA. Le IKB transgénique / – ligne a été généré en utilisant un mutant négatif trans-dominant de NF-kB inhibiteur IκBa (super-répresseur IκBa-AA1) 8. Contrairement à la IKBa de type sauvage, IKBa-AA1 a deux des résidus de sérine mutés en alanines (V32 et V36), qui empêchent la phosphorylation et la dégradation par le protéasome ultérieure de l'inhibiteur. Pour cerveau antérieur expression spécifique des neurones de la IκBa-AA1-transgène, IkB / – souris ont été croisées avec des souris hébergeant une kinase calcium-calmoduline-dépendante IIa (CAMKIIα)-promoteur qui peut être entraîné par trans-activateur tétracycline (TTA) 9.
souris knock-out p65 ont un phénotype létal embryonnaire, en raison de l'apoptose massif du foie 10, si l'approche présentée ici fournit une méthode éléganted'enquêter sur le rôle de NF-kB dans postnatale et la neurogenèse adulte.
Le test de comportement classique pour étudier l'apprentissage spatial et la mémoire a été décrit dans les années 1980 par Richard Morris, un test connu sous le nom d'eau de Morris (MWM) 11. Dans ce champ ouvert eau-labyrinthe, les animaux apprennent à sortir de l'eau opaque sur une plate-forme cachée fondée sur l'orientation et extra-labyrinthe repères. Une variante sec de MWM est le labyrinthe Barnes dite (BM) 12. Ce test utilise une plaque circulaire de 20 trous circulaires disposés à la frontière d'une plaque, avec un trou défini comme une boîte d'échappement, et des repères visuels extra-labyrinthe d'orientation. Les deux paradigmes expérimentaux reposent sur le comportement de vol induite par un rongeur de l `aversion pour l'eau, ou des espaces ouverts, illuminées. Les deux tests permettent une enquête de l'orientation spatiale, et la performance de mémoire liée. Bien que l'hippocampe joue un rôle essentiel et en général la formation de la mémoire spatiale, l'hippocampe rÉGIONS impliqués diffèrent selon le critère appliqué. La mémoire testé en BM découle de l'activité neuronale entre le cortex enthorinal (CE) et les neurones pyramidaux situés dans la région CA1-de l'hippocampe sans contribution de la DG 13-16. En particulier, la BM classique repose principalement sur la navigation par la voie temporo-ammonique monosynaptic de CE III CA1 à CE V. Surtout, la DG est cruciale impliquée dans la configuration dite reconnaissance spatiale 17, ce qui implique non seulement le traitement des l'information visuelle et spatiale, mais aussi la transformation des représentations ou des souvenirs similaires dans différents, les représentations ne se chevauchent pas. Cette tâche requiert un circuit tri-synaptique fonctionnelle du CE II DG de CA3 de CA1 et CE VI, qui ne peuvent être testés dans le BM 15.
Pour relever ces défis, nous avons conçu SPS-BM comme un test de comportement pour tester spécifiquement denté performances cognitives gyrus dépendant en coanimaux ntrol, et dans le modèle super-répresseur IKB / TTA suite à l'inhibition de NF-kB. Néanmoins, contrairement à la MWM ou la BM, le SPS-BM peut révéler des déficits comportementaux subtils résultant de la dépréciation de la neurogenèse. Depuis spatiale motif de séparation est strictement dépendante d'un circuit fonctionnel entre la CE II et la DG et CA3 et CA1 et CE VI, ce test est très sensible aux changements potentiels dans la neurogénèse, les modifications de la voie des fibres moussues ou altérations de l'homéostasie tissulaire au sein de la DG.
Techniquement, la mise en place de notre test est basé sur l'étude de Clelland et al., Dans lequel le motif de la séparation spatiale a été testé en utilisant un bois 8-bras bras labyrinthe radial (RAM) 19. Dans notre set-up modifié, les huit bras ont été remplacés par sept maisons jaunes alimentaires identiques. En résumé, les méthodes présentées ici, y compris l'analyse de (DCX +) des cellules de doublecortine exprimant dans l'hippocampe, les projections de fibres moussues, neuronale cellule death et en particulier le SPS-BM présenté ici, peut être appliquée à des enquêtes sur d'autres modèles de souris comportant des transgènes qui ont un impact sur la neurogenèse adulte. D'autres applications peuvent inclure l'étude des agents pharmacologiques et mesurer leur impact sur le modèle de séparation DG et spatiale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neurogenèse adulte, et la possibilité de sa manipulation par l'inhibition de NF-kB dans les neurones, et sa réactivation plus tard par la doxycycline, propose un système fascinant pour les enquêtes sur les nouveaux neurones dans le cerveau adulte, ainsi que dans des neurones de-et re-génération . La beauté de ce système est que le NF-kB voie de signalisation inhibition des neurones non seulement entraîne des changements dans la mort des cellules neuronales, la prolifération des progéniteurs et la migrati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Angela Kralemann-Köhler pour un excellent soutien technique. Le travail expérimental décrit ici a été réalisée dans notre laboratoire et a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en allemand (DFG) à CK et BK et une subvention du ministère allemand de la Recherche et de l'Education (BMBF) à BK.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
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