Fremgangsmåder til manipulation og analyse af NF-KB-afhængige voksne hippocampus neurogenese beskrevet. En detaljeret protokol præsenteres for en dentatgyrus-afhængig adfærdsmæssige test (betegnet den rumlige mønster separation-Barnes labyrint) til undersøgelse af kognitive udfald i mus. Denne teknik bør også bidrage til, at undersøgelser i andre eksperimentelle indstillinger.
Hippocampus spiller en central rolle i dannelsen og konsolideringen af episodiske erindringer, og i rumlig orientering. Historisk har den voksne hippocampus blevet set som en meget statisk anatomisk region i pattedyrs hjerne. Imidlertid har de seneste resultater vist, at dentatgyrus af hippocampus er et område af enorm plasticitet hos voksne, der ikke kun ændringer af eksisterende neuronale kredsløb, men også voksne neurogenese. Denne plasticitet reguleres af komplekse transkriptionelle netværk, hvori transskriptionsfaktoren NF-KB spiller en fremtrædende rolle. For at undersøge og manipulere voksen neurogenese en transgen musemodel til forhjerne-specifik neuronal inhibering af NF-KB-aktivitet kan anvendes.
I denne undersøgelse er beskrevne fremgangsmåder til analyse af NF-KB-afhængige neurogenese, herunder de strukturelle aspekter, neuronal apoptose og progenitor proliferation og kognitiv betydning, which specifikt vurderet via en dentatgyrus (DG)-afhængige adfærdsmæssige test, den rumlige mønster separation-Barnes labyrint (SPS-BM). SPS-BM-protokollen kan kun tilpasses til brug med andre transgene dyremodeller designet til at vurdere indflydelsen af bestemte gener på voksen hippocampus neurogenese. Endvidere kunne SPS-BM anvendes i andre eksperimentelle indstillinger med henblik på at undersøge og manipulere DG-afhængig læring, for eksempel ved hjælp farmakologiske midler.
Ontologisk, hippocampus er en af de ældste anatomiske hjernens strukturer kendt. Den er ansvarlig for diverse komplekse opgaver, såsom centrale funktioner i reguleringen af langtidshukommelse, rumlig orientering og dannelse og konsolidering af den respektive hukommelse. Anatomisk hippocampus består af pyramideformede cellelag (stratum pyramidale), herunder cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 og CA4) regioner og gyrus dentatus (gyrus dentatus), som indeholder granuleceller og et par neuronale progenitorceller inden for dens subgranular zone . De granulceller rage mod CA3 region via såkaldte mosagtige fibre (axoner af granula celler).
Indtil slutningen af det sidste århundrede blev pattedyrhjernen voksne menes at være en statisk organ mangler cellulære plasticitet og neurogenese. Men i løbet af de sidste to årtier, viser en voksende mængde af beviser voksen neurogenese finder sted i klart mindstto områder af hjernen, den subventricular zone (SVZ) og subgranular zone af hippocampus.
Vores tidligere undersøgelser, og de andre grupper, har vist, at transkriptionsfaktoren NF-KB er en af de afgørende molekylære regulatorer af voksne neurogenese, og at dets dereguleringsforslag resulterer i alvorlige strukturelle hippocampus defekter og kognitive handicap 1-6. NF-KB er det generiske navn på en inducerbar transskription faktor sammensat af forskellige dimeriske kombinationer af fem DNA-bindende subunits: P50, P52, c-Rel, RelB og p65 (RelA), sidstnævnte hvoraf tre har transaktiveringsassays domæner. I hjernen, den mest udbredte form, findes i cytoplasmaet er en heterodimer af p50 og p65, som er holdt i en inaktiv form af inhibitor af kappa B (IKB)-proteiner.
At studere og direkte manipulere NF-KB-drevne neurogenese, bruger vi transgene musemodeller for at muliggøre enkel hæmning af alt NF-KB-subunsin, specifikt i forhjernen 7 (se figur 1). Til dette formål, vi krydsavlet følgende transgene mus linjer, IKB / – og -/tTA. De transgene IKB / – line blev genereret ved hjælp af en trans-dominant negativ mutant af NF-KB-hæmmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8.. I modsætning til vildtype-IκBα, IκBα-AA1 har to serinrester muteret til alaniner (V32 og V36), som hindrer phosphorylering og efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning af inhibitoren. For forebrain neuron-specifikt udtryk for det IκBa-AA1-transgen, IKB / – blev mus krydset med mus, der huser et calcium-calmodulin kinase IIα (CAMKIIα)-promotor, som kan drives af tetracyclin trans-aktivator (tTA) 9..
p65-knock-out-mus har en embryonisk letal fænotype skyldes massiv leveren apoptose 10, så den fremgangsmåde, der er vist her giver en elegant metodefor at undersøge betydningen af NF-KB i postnatal og voksne neurogenese.
Den klassiske adfærdstest at studere rumlig indlæring og hukommelse, blev beskrevet i 1980'erne af Richard Morris, en test kendt som Morris water-labyrint (MWM) 11. I denne friland vand-labyrint, lære dyrene at flygte fra uigennemsigtig vand på en skjult platform baseret på orientering og ekstra-labyrint signaler. En tør variant af MWM er den såkaldte Barnes labyrint (BM) 12. Denne test benytter en cirkulær plade med 20 runde huller arrangeret på grænsen af en plade, med en defineret hullet som en flugt kasse og visuelle ekstra labyrint stikord til orientering. Både eksperimentelle paradigmer stole på flyvningen adfærd fremkaldt af en gnaver `s aversion mod vand, eller åbne, stærkt oplyste rum. Begge test tillade en undersøgelse af rumlig orientering, og den relaterede hukommelse ydeevne. Selv hippocampus spiller en generel og væsentlig rolle i den rumlige hukommelse dannelse, hippocampus rEGIONSUDVALGET involverede varierer afhængigt af testen anvendt. Det testede i BM hukommelse opstår neuronal aktivitet mellem enthorinal cortex (EF) og pyramideneuroner placeret i CA1-regionen af hippocampus uden et bidrag fra GD 13-16. Især den klassiske BM primært afhængig navigation via den monosynaptiske temporo-ammonic vej fra EF III til CA1 til EF V. Vigtigt er det GD afgørende involveret i den såkaldte rumlige mønstergenkendelse 17, hvilket indebærer ikke blot behandling af visuel og geografisk information, men også omdannelsen af lignende repræsentationer eller minder til Forskelligartede nonoverlapping repræsentationer. Denne opgave kræver en funktionel tri-synaptiske kredsløb fra EF II til GD til CA3 til CA1 og EF-VI, der ikke kan testes i BM 15.
For at imødegå disse udfordringer, har vi udtænkt SPS-BM som en adfærdsmæssig test til specifikt at teste dentatgyrus-afhængige kognitiv præstation i samarbejdentrol dyr, og IKB / tTA super-repressor model efter NF-KB-inhibering. Vigtigere er det, i modsætning til MWM eller BM kan SPS-BM afslører subtile adfærdsmæssige mangler som følge af forringelse af neurogenese. Da rumlig-mønster-separation er strengt afhængig af en velfungerende kredsløb mellem EF II og GD og CA3 og CA1 og EC VI, denne test er meget følsom over for mulige ændringer i neurogenesis, ændringer af mosbegroet fiber gangsti eller forandringer af vævshomeostase inden for DG.
Teknisk set er det set-up af vores test er baseret på den undersøgelse, som Clelland et al., Hvor den rumlige adskillelse mønster blev testet ved hjælp af en træ 8-arm radialarmssaven labyrint (RAM) 19. I vores modificeret set-up, blev de otte arme erstattet af syv identiske gule fødevarer huse. Sammenfattende fremgangsmåderne vist her, herunder analyse af doublecortin-udtrykkende (DCX +) celler i hippocampus, den mossy fiber fremspring, neuronal celle death og især SPS-BM præsenteres her, kan anvendes til undersøgelser af andre musemodeller inkorporerer transgener, der har en indvirkning på voksen neurogenese. Yderligere anvendelser kan omfatte undersøgelse af farmakologiske midler og måle deres indvirkning på GD og rumlig mønster adskillelse.
Voksen neurogenese, og muligheden for manipulation via hæmning af NF-KB i neuroner, og dets senere reaktivering via doxycyclin, giver et fascinerende system for undersøgelser af nyfødte neuroner i den voksne hjerne, samt i neuronal de-og re-generation . Skønheden i dette system er, at NF-KB-signalvejen hæmning i neuroner ikke kun resulterer i ændringer i neuronal celledød, stamfader proliferation og migration, alvorlige strukturelle og anatomiske ændringer, men også på åbenlyse mangler læring. Vigtigere, kan…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Angela Kralemann-Köhler for fremragende teknisk support. Eksperimentelt arbejde beskrevet heri blev udført i vores laboratorium, og blev støttet af tilskud fra forskningsråd tysk (DFG) til CK og BK og et tilskud af det tyske ministerium for forskning og uddannelse (BMBF) til BK.
Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |