我们提出了一个协议,用于在体外研究铜绿假单胞菌外排泵。该协议允许对脂质体膜中的健壮的,可逆的,可调谐的质子梯度的产生,因此,应能适应由protomotive力激励任何膜蛋白。
有一个新兴的科学需要可靠的工具,用于监测膜蛋白转运。我们提出了一种方法,从而导致外排泵的重构来自于一个仿生环境中的革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌 ,允许其传输的活动的准确调查。三个先决条件得到满足:隔在脂质环境中,用于交通运输相关的索引,并产生质子梯度。膜蛋白转运重组到脂质体与细菌视紫红质,光活化的质子泵,其产生的质子梯度是健壮以及可逆的和可调谐在一起。该蛋白质的活性,从脂质体内部发生的pH值的变化推导出,用pyranin,pH依赖的荧光探针。我们描述一个一步一步的过程,其中的膜蛋白的纯化,脂质体形成,重组蛋白,和运输nalysis得到解决。尽管它们对于RND转运是专门设计的,所描述的方法可能适于与任何其他膜蛋白转运蛋白由一个质子梯度通电使用。
整合膜蛋白表示编码在真核基因组基因的高达30%。他们分享举足轻重的角色,如守门(受体),运送营养物质,离子或有毒化合物(运输)或维护跨双层膜(通道)的渗透率在所有活细胞1。外排泵具有抵抗抗生素治疗2核心作用。在革兰氏阴性菌绿脓杆菌 ,它是由一外保护膜,外排转运体被组织为三方系统中MexB,外排泵位于内膜,工程与MEXA,周质蛋白,和OprM的同时,一个外膜通道。胞质内的膜蛋白充当能量依赖性泵具有广泛的底物特异性。外膜蛋白充当孔蛋白,而第三个是位于周质空间和被认为是稳定的整体复杂<s了> 3。在下文中,我们集中在功能测定法对MEXA MexB组件的设计。
结构信息也累积了过去5年由于从大肠杆菌 4-7的同源蛋白ACRB的X射线测定。虽然这显然是重要的夫妇这样的信息与动态和动力学数据,设计一个功能测定该转运是一个真正的挑战8。事实上,膜蛋白,必须保持在一个膜质环境和封闭的隔室必须保持基底的矢量传输来实现。
膜蛋白为蛋白脂质体的重组已被广泛介绍和审查(见里戈和Levy 9)。这些协议允许通过在脂质体膜后的基板的监测膜蛋白活性的,例如。在这种情况下的限制产生的一个滴定基板vailability(荧光,放射性等 ),并从该很多时候,这些底物是疏水性的,有一种倾向,越过膜而与转运蛋白的存在的事实。作为一种替代方法,可以跟随一个报告染料对所发生的一种运输后果化学变化敏感的光谱变化。如上所述,质子通过MexB通电运输。因此,一个相关的方法是监控一个pH敏感的报告染料跟随由于质子驱动的基板传输pH值的变化的光谱变化。荧光染料的选择范围可避免由于衬底的疏水性质的任何伪迹影响。
一个额外的困难是质子梯度的产生。多种协议可在文献中找到。其中,利用霉素技术是普遍,但我们已经表明,它是乏味的执行10-11。此外,它是不能再现,这是不可逆的。我们已经使出了利用细菌视紫红质(BR),从Halobacter salinarium光激活的质子泵,一种嗜盐的海洋革兰氏阴性需氧预留古菌的。这种蛋白质是coreconstituted到脂质体与MexB,一经光照,BR泵的脂质体的内部的质子,从而创建ΔPH(酸性内)运送基板12-13所需要的蛋白质。
我们描述了一个重建的过程设计为测定膜蛋白转运。一旦建立,蛋白质重组过程导致的测量是非常可重复的。然而,对于重构的蛋白质的精确条件将随蛋白质的其他。多,必须小心在优化参数如下: 纯化 (纯度和不存在聚集的材料) 的 ⅰ) 质量 ; 洗涤剂增溶步骤 (如果可能的ⅱ)效率,低临界胶束浓度的洗涤剂,应优选的,因为它们是容易得到除掉);ⅲ) 解吸洗涤剂 (它是例如可以使用聚苯乙烯珠与透析步骤结合起来,但这样做可能影响解吸的速率,用于所述蛋白质的后续活动的一个关键参数,参见文献[ 9]);ⅳ) 脂质重构 (脂质的化学性质,所述脂质与蛋白质的比率,额外amphiph存在尔斯是必须改变和优化)的关键参数。除了温度和保温时间影响所有这些问题。
质量控制是这样始基在重建过程中的每个步骤。从这个角度来看,光散射是一个非常方便的方法,因为它是快速的,非破坏性的,并且只需要20微升样品中的浓度在微摩尔范围。一旦脂蛋白形成,蔗糖梯度也有很大帮助,因为它打开对重组进行系统的核查方式:定性(是蛋白质确实嵌入脂质体膜)和定量(多少蛋白质在一个脂质体)。后者将通过精确地测量所述蛋白质和脂质的浓度加以解决。
我们的分析并不依赖于基板本身的滴定和这避免了关于可能的伪迹被动扩散不安因素的分子由于在膜的疏水性划分。该实验利用羟基芘磺酸作为一种可靠的和定量的探针,用于监测pH值的变化特性。我们的结果与使用霉素10在其中执行质子梯度的形成另一个程序得到的结果一致,但它允许一个更强大的和可重复的梯度11。此外,该质子梯度可以精确调整,简单地通过改变缓冲液的浓度(对于进一步的细节见Verchere 等人 12)。
在首先在不存在衬底的执行的控制测量过程(这可以访问该蛋白质的被动活动)。后的基板已在同一比色杯中添加实际的膜蛋白转运蛋白活性,然后测量。这是真正的资产,因为该实验可以被认为是一个真正的,非模糊的,底物诱导的结果。
ENT“>的协议可以适用于高介质的吞吐量(例如96孔测量)自动化,因为照射样本触发反应。自动化和并行化将包括在制备大批量的脂蛋白体,并在一个96等份分装井板。衬底(以及还可能的抑制剂)将被添加并在黑暗中孵育45分钟后,该板会受到光照/羟基芘磺酸荧光测量周期上酶标仪。有关协议的更多信息,欢迎读者阅读Verchere 等 。12,13
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由国立新电德拉RECHERCHE(项目ANR-2010-BLAN-1535),并从一个地区法兰西岛大区法国(DIM-Malinf 110058)的资助。
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C |
Cholesterol | Sigma Aldrich | C8667 |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 |
Valinomycin | Invitrogen | V-1644 |
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid) | Invitrogen | H-348 |
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside) | Affymetrix | D310LA |
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes) | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 |
Econo-Pac Chromatography empty column | Biorad | 732-1010 |
Desalting columns | Bio-Rad | 54805 |
Dynamic light scattering instrument | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar |
Fluorometer JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |