La spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières est une méthode précise et rapide pour analyser différents modes d’activation des macrophages

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières sur des cellules eucaryotes. Ici, nous illustrons la précision de cette technique en analysant les multiples états d’activation des macrophages en réponse à leur microenvironnement.

Résumé

MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse largement utilisée en chimie et en biochimie. Il a également été appliqué en médecine pour identifier des molécules et des biomarqueurs. Récemment, il a été utilisé en microbiologie pour l’identification de routine des bactéries cultivées à partir d’échantillons cliniques, sans étapes de préparation ou de fractionnement. Avec d’autres, nous avons appliqué avec succès cette technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières à des cellules eucaryotes. Les applications actuelles vont de l’identification des types de cellules à l’évaluation du contrôle de la qualité des cultures cellulaires et aux applications de diagnostic. Ici, nous décrivons son utilisation pour explorer les différents phénotypes de polarisation des macrophages en réponse aux cytokines ou aux bactéries tuées par la chaleur. Il a permis d’identifier des empreintes spécifiques aux macrophages qui sont représentatives de la diversité des réponses protéomiques des macrophages. Cette application illustre la précision et la simplicité de la méthode. Le protocole que nous avons décrit ici peut être utile pour étudier la réponse immunitaire de l’hôte dans des conditions pathologiques ou peut être étendu à des applications diagnostiques plus larges.

Introduction

La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) est une technique de spectrométrie de masse populaire pour étudier les échantillons biologiques. L’utilisation d’un faisceau laser et d’une matrice absorbant l’énergie permet un processus d’ionisation douce : l’évaporation et la genèse de grandes biomolécules, pour la plupart monochargées. Ce processus est appelé désorption/ionisation, d’où l’acronyme MALDI. Ces ions sont ensuite accélérés par application de tension et entrent dans un analyseur TOF qui permet la séparation de ces ions et la quantification de leurs masses^respectives1.

Protocole

Dans le protocole actuel, la technique MALDI-TOF à cellule entière est utilisée pour obtenir un spectre de masse considéré comme une empreinte digitale de l’échantillon. Une analyse bioinformatique a permis la comparaison et la classification de ces empreintes digitales. Ce protocole comportait trois parties principales :

1. La préparation des échantillons biologiques : macrophages de contrôle et macrophages stimulés par différents agonistes.
2. L’analyse de chaque type d’échantillon avec des réplicats techniques par MALDI-TOF MS à cellules entières.
3. L’analyse bioinformatique de données brutes.

Préparer de....

Résultats

L'objectif du présent protocole est de démontrer la précision de la spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules entières pour évaluer la réactivité des macrophages à leur microenvironnement.

Figure 1 décrit la préparation de macrophages stimulés à partir d'échantillons sanguins. Figure 2 représente l'analyse des monocytes et des MDM par cytométrie en flux. Remarquez que les monocytes exprimaient CD14 mais pas CD68 (Figure 1A). En revanche, l.......

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de MALDI-TOF-MS sur des cellules entières eucaryotes. Ici, nous illustrons la précision de la méthode en analysant les multiples états d’activation des macrophages en réponse à leur microenvironnement.

Le succès du protocole repose sur quelques étapes critiques. Tout d’abord, tout contaminant en solution peut modifier les spectres. Par exemple, il est important de laver les cellules dans le PBS pour éliminer le milieu de culture et les protéines sériques avant.......